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目的:糖皮质激素是一种有效的抗炎药物,是控制哮喘的一线药物。然而,一些哮喘患者在经过高剂量的糖皮质激素治疗后仍得不到临床控制,这一类型的哮喘被称为激素抵抗型哮喘。因为激素抵抗型哮喘症状较重,病程长,药物治疗效果不佳,易出现难治性咳喘,长期使用激素药物更易造成虚损体质,这类疾病可以归为中医的“顽哮”、“虚喘”的疾病范畴。“顽哮虚喘”的病机特点多以肺虚、肾虚为本,以风、寒、热、湿、痰、瘀为标。基于激素抵抗型哮喘病位在肺,病根在肾,以虚为本的病机特点,本课题提出具有补益肺肾功效的中药能治疗激素抵抗型哮喘的假设。具有补肾功效的喘可治注射液和具有补肺功效的ASHMI是治疗哮喘的中药复方制剂,前期的研究已证实了这两中药复方治疗哮喘的有效性。喘可治注射液是国家Ⅱ类新药,由淫羊藿和巴戟天组成,具有温阳补肾,平喘止咳的功效。本研究将探索喘可治对激素抵抗细胞模型的影响,研究其是否能逆转激素抵抗的状态,并对其抗炎药效物质基础和作用机制进行研究。ASHMI是经美国FDA批准进行治疗哮喘临床试验的中药复方,由灵芝、甘草、苦参组成。其中主药灵芝具有补益肺气、止咳平喘的功效,可以治疗虚劳咳喘。前期研究我们通过体外实验发现灵芝的成分GAC1是ASHMI发挥抗炎作用的活性化合物。本次研究将继续从体内实验评估GAC1在激素抵抗哮喘小鼠模型中的作用,以开发针对激素抵抗型哮喘的天然产物,并研究其潜在的作用机制。方法:1.体外实验构建激素抵抗的细胞模型:使用LPS/IFNγ刺激RAW 264.7细胞,并用地塞米松处理后,ELISA检测TNF-α含量,western blot糖皮质激素受体核转移情况。2.体内实验构建激素抵抗的哮喘小鼠模型:用豚草腹腔注射致敏及鼻内激发Balb/c小鼠建立哮喘小鼠模型。致敏后,在最后一次激发前24和48小时给予急性地塞米松治疗。在最后一次豚草激发48小时后,乙酰甲胆碱诱发气道高反应,检测小鼠气道高反应性,用ELISA方法测量肺泡气道灌流液中TNF-α,IL-4,IL-5和IFN-γ等细胞因子的含量,细胞涂片HE染色观察肺泡灌流液中炎症细胞的分类情况。3.喘可治对激素抵抗细胞模型的作用及药效物质基础研究:使用脂多糖LPS诱导巨噬细胞系Raw 264.7产生炎症反应,运用ELISA检测喘可治及其组成淫羊藿、巴戟天对炎症因子TNF-a的抑制作用,western blot检测淫羊藿对NF-κB和MAPK信号通路中p-IkBa,IkBa,p-JNK,JNK,p-p38,p38,p-ERK,ERK 蛋白的影响。ELISA 方法观察淫羊藿联合地塞米松对TNF-α的影响,以及western blot方法检测淫羊藿联合地塞米松对糖皮质激素受体核转移的影响。用液相色谱法鉴定淫羊藿含量最高的几个化合物,ELISA方法筛选出能抑制LPS诱导Raw 264.7产生的TNF-α的单体,western blot和细胞免疫荧光法检测该单体对LPS诱导的IkB-α磷酸化和NF-κ B p65核转移的影响,分子对接方法预测该单体与Toll-like receptor/NF-κ B信号通路上的蛋白的结合,CETSA技术验证Icarrin与TAB2结合情况,Real-time PCR技术检测单体对TAK1,TAB1,TAB2 mRNA表达的影响。4.体内实验观察GAC1对豚草诱导的哮喘小鼠模型的影响:用豚草腹腔注射致敏及鼻内激发Balb/c小鼠建立哮喘小鼠模型。致敏后,GAC1治疗4周。乙酰甲胆碱诱发气道高反应,检测小鼠气道高反应性,用ELISA方法测量肺泡气道灌流液中TNF-α,IL-4,IL-5和IFN-γ等细胞因子的含量,细胞涂片HE染色观察肺泡灌流液中炎症细胞的分类情况,肺切片HE染色用于观察气管与血管炎症浸润情况,用western blot技术测定肺组织p-p65,p-PI3K,p-Akt,p-STAT6和HDAC2蛋白的表达情况。结果:1.成功构建激素抵抗的细胞模型。地塞米松无法抑制LPS/IFN-γ诱导RAW 264.7细胞产生的TNF-α,无法明显地促进糖皮质激素受体核转移。2.成功构建豚草致敏的哮喘小鼠。豚草致敏哮喘小鼠气道反应性增强,BALF中白细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞增多,IL-4、IL-5、IFN-γ和TNF-α细胞因子增多。而地塞米松无法降低气道高反应和减少BALF中中性粒细胞炎症和TNF-α细胞因子。3.淫羊藿恢复激素敏感性。喘可治及其组成淫羊藿能抑制LPS诱导产生的TNF-α,并且能抑制I κ B-α和JNK蛋白的磷酸化。淫羊藿和地塞米松联用能抑制LPS/IFN-γ诱导Raw 264.7细胞产生地塞米松抵抗的TNF-α。淫羊藿和地塞米松联用能促进糖皮质激素受体核转移,而淫羊藿本身无法促进糖皮质激素受体核转移。4.淫羊藿抗炎物质基础及作用机制。液相色谱法鉴定了淫羊藿中含量最高的8种化合物,其中Icarrin对LPS诱导的TNF-α的抑制作用最强。Icarrin能剂量依赖地抑制TNF-α的mRNA和蛋白水平,并且能抑制I κ B-α磷酸化和NF κB p65蛋白核转移。分子对接结果显示Icarrin与Toll-like receptor/NF-κ B信号通路上的TAB2蛋白有16个结合位点。CETSA结果显示Icarrin能与TAB2结合,而不影响TAB2基因的表达。5.GAC1对激素抵抗哮喘模型的治疗作用。从ASHMI分离的活性化合物GAC1,能减少哮喘小鼠的气道和血管炎症细胞浸润,降低气道高反应,减少气道肺泡灌流液中的IL-4,IL-5和TNF-α细胞因子,增加IFN-γ细胞因子,抑制肺内NF κ B,PI3K和Akt蛋白的磷酸化,恢复HDAC2蛋白表达。结论:激素抵抗的细胞模型和哮喘小鼠模型的构建有利于开发治疗激素抵抗疾病的药物。淫羊藿能逆转LPS/IFN-γ引起的激素抵抗,为其在临床上与地塞米松联合治疗激素抵抗性疾病提供依据。Icarrin是淫羊藿中起抗炎作用的活性化合物,它发挥抗炎作用的机制可能是通过与TAB2蛋白结合,影响TAK1-TAB1-TAB2复合物形成,影响NF-κ B通路的活化,从而抑制炎症因子的产生。GAC1可能是一种很有前景的治疗哮喘中药单体,可用于治疗中性粒细胞主导且有激素抵抗的哮喘。