论文部分内容阅读
目的:新兴的联合门静脉结扎和肝脏离断的二步肝切除术(ALPPS)能刺激肝脏快速再生,但具体机制尚未阐明。近年来的研究表明,骨髓源肝血窦内皮祖细胞(bone marrow derived liver sinusoidal endothelial progenitor cells,BM SPCs)的募集是肝再生的必要条件,而血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是这一过程的关键调控者。据此,我们推测BM SPCs可能在ALPPS术后肝再生中发挥着重要的作用。本课题,首先制备大鼠ALPPS术模型,经组织学、肝功能和免疫组化染色评估术后肝再生情况;然后通过免疫荧光染色、PCR和Western Blot方法,观察BM SPCs在ALPPS术后肝组织中的募集情况以及VEGF的表达情况,来评估BM SPCs在ALPPS术后肝再生中的作用。第一部分:大鼠ALPPS手术模型的建立方法:90只健康的SD雄性大鼠随机分为ALPPS手术组、肝脏门静脉结扎组(PVL组)和假手术组(Sham手术组),每组各30只各组设置1、2、3、5和7天五个时间点。ALPPS手术组采用门静脉80%分支结扎以及原位离断肝脏实质制作ALPPS大鼠模型,PVL组为80%门静脉结扎大鼠,Sham组为仅开腹后翻动肝脏数次后即关腹。各组于各时相点处死动物取材,取肝组织和血清进行以下实验:右中叶肝脏与大鼠体重比重的计算;HE染色检测肝组织病理变化,肝脏组织Ki-67免疫组化染色检测肝脏细胞增殖情况;血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和总胆红素(TBIL)测定检测肝功能状况。结果:(1)ALPPS手术组与PVL手术组相比,在各时相点肝脏生长率均显著升高(p<0.05)。(2)ALPPS手术组与PVL手术组相比,肝脏组织损伤更严重并可见Ki-67阳性细胞明显增多。(3)ALPPS手术组与PVL手术组相比,血清ALT、AST和TBIL水平在术后第一天显著升高(p<0.05),第三天开始显著下降并回到正常水平。第二部分:BM SPCs在大鼠ALPPS术后肝再生中的作用研究目的:评估BM SPCs在大鼠ALPPS术后在肝再生中的作用规律。方法:在第一部分取材肝组织和血清的基础上,采用免疫荧光染色检测骨髓源肝血窦内皮祖细胞的表面标志物CD133、CD45和CD31的表达情况,通过PCR实验检测肝脏组织中的血清肝生长因子(HGF)和VEGF的mRNA表达水平,并进一步用Western Blot方法检测HGF和VEGF蛋白的表达情况。此外,测定了的HGF表达水平。结果:(1)ALPPS手术后大鼠肝脏结扎侧可见呈CD31~+CD133~+和CD45~+CD133~+阳性的骨髓源肝血窦内皮祖细胞,但是在ALPPS手术组肝脏保留侧、PVL组和Sham组中均未见CD31+CD133+和CD45+CD133+阳性的细胞。(2)ALPPS组与PVL组相比,大鼠肝脏组织HGF mRNA水平显著升高,并且ALPPS手术后大鼠肝脏保留侧HGF mRNA水平随着术后时间的延长而逐渐下降,与此相反,肝脏结扎侧HGF mRNA表达水平随着时间的推移一直升高;随后Western Blot方法进一步证实了HGF蛋白表达与其转录水平一致。(3)ALPPS组与PVL组相比,大鼠肝脏组织VEGF mRNA水平显著升高,并且ALPPS手术后大鼠肝脏保留侧VEGF mRNA水平随着时间的推移一直下降,而肝脏结扎侧VEGF mRNA表达水平在术后第1天和第2天呈上升趋势,并在第2天达到峰值,之后则随着术后时间的延长而逐渐下降;随后Western Blot方法检测VEGF蛋白表达发现ALPPS手术后的第1、2天和3天中,肝脏保留侧的VEGF蛋白水平一直是低于肝脏结扎侧,并且肝脏保留侧的VEGF蛋白水平在术后第1天和第2天呈下降趋势,然而自第3天起VEGF蛋白水平反而开始上升;肝脏结扎侧VEGF蛋白水平的表达与其转录水平一致。结论:1、ALPPS术后肝组织再生显著提高,成功制备了大鼠ALPPS手术模型;2、BM SPCs可大量募集于ALPPS术后肝组织中,并可分泌高水平的肝生长因子;3、BM SPCs可能通过VEGF介导募集到肝损伤部分从而促进了ALPPS术后肝再生。