【摘 要】
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真菌来源的次级代谢产物结构复杂、活性多样,是临床药物、农药和食品添加剂等的重要来源。真菌基因组中存在大量次级代谢产物合成基因簇,聚酮合酶（Polyketide Synthase,PKS）和非核糖体多肽合成酶（Non-ribosomal Peptide synthetase,NRPS）是其中重要的两大类结构复杂、功能多样的巨型酶,其产生的聚酮化合物（Polyketide,PK）和非核糖体肽（Non-
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真菌来源的次级代谢产物结构复杂、活性多样,是临床药物、农药和食品添加剂等的重要来源。真菌基因组中存在大量次级代谢产物合成基因簇,聚酮合酶（Polyketide Synthase,PKS）和非核糖体多肽合成酶（Non-ribosomal Peptide synthetase,NRPS）是其中重要的两大类结构复杂、功能多样的巨型酶,其产生的聚酮化合物（Polyketide,PK）和非核糖体肽（Non-ribosomal Peptide,NRP）类化合物结构多样,是抗细菌、抗真菌和抗肿瘤药物的重要来源,在临床医药领域有广泛的应用。目前从真菌中分离得到的聚酮和非核糖体肽类化合物的数量远远小于真菌中所含的编码聚酮合酶和非核糖体多肽合成酶基因簇的数量,说明许多基因簇在常规实验室条件下不表达或表达量低。通过过表达转录调节因子和异源宿主表达的手段获得新的天然产物是真菌基因组挖掘的主要目的。本文通过传统的分离策略,挖掘菜豆壳球孢菌Macrophomina phaseolina ACCC 39267中的活性天然产物;通过对希金斯炭疽菌Colletotrichum higginsianum ACCC 37053的基因组序列进行生物信息学分析,发现两个未知的PKS-NRPS合成基因簇,并通过构建合适的遗传表达体系对其进行研究,具体的研究结果如下:1、以PDA为培养基大规模发酵菜豆壳球孢菌,经中压制备色谱和高效液相色谱（High-performance Liquid Chromatography,HPLC）分离得到两个同分异构的天然环肽,其分子式为C30H55N5O5,分子量均为565,在220 nm处有较强的紫外吸收,通过抑菌实验测试中未表现出明显的抑制作用。2、对希金斯炭疽菌基因组进行分析,发现一个未知的含有多个修饰基因的PKS-NRPS杂合基因簇ACCC68.1,以构巢曲霉Aspergillus nidulans A1145为异源宿主,构建重组质粒对基因簇进行表达。单独表达骨架结构基因PKS-NRPS产生了化合物3和4,化合物3的分子量为433,在213 nm处有较强的紫外吸收,化合物4的分子量为403,在196 nm处有较强的紫外吸收。化合物3对结核分枝杆菌具有较强的抑制作用,化合物4对结核分枝杆菌和枯草芽孢杆菌表现出中度抑制作用;将骨架结构基因和后修饰基因同时在构巢曲霉中表达,结果仍只产生了化合物3和4,表明后修饰基因在异源表达系统中不起作用;而RT-PCR结果显示后修饰基因在构巢曲霉表达体系中转录正确,后修饰基因没有识别化合物3和4进行下一步的转化,提示化合物3和4都不是骨架结构基因PKS-NRPS表达的中间产物,真正的中间产物被构巢曲霉本身所修饰;为了得到骨架结构基因PKS-NRPS表达的中间产物,在另一异源宿主米曲霉Aspergillus oryzae RIB40中表达骨架结构基因PKS-NRPS,经LC-MS检测,其表达产物的出峰时间、最大紫外吸收和分子量与化合物4一致,为同一化合物,证明了骨架结构基因PKS-NRPS在米曲霉中的表达产物也同样被异源宿主所修饰,未能得到真正的中间产物;本实验尝试将基因簇ACCC68.1在构巢曲霉和米曲霉中进行异源表达,但由于骨架结构基因产生的中间产物被异源宿主修饰,该生物合成途径中断,于是通过过表达ACCC68.1基因簇的转录调节因子（Transcriptional Factor,TF）,希望通过特异性激活ACCC68.1基因簇而获得最终产物,但结果并未成功。3、对希金斯炭疽菌基因组中另一个未知的PKS-NRPS基因簇进行研究,其基因簇包含了一个PKS-NRPS、烯酰还原酶（Enoyl Reductase,ER）和FAD依赖氧化酶（FAD-dependent Oxidase）,构建了两个重组质粒在构巢曲霉中异源表达。结果显示,单独表达骨架结构基因PKS-NRPS产生了化合物5,分子量为295,在230 nm处有较强的紫外吸收,分子式为C17H29NO3,根据一维二维核磁光谱解析了化合物5的结构,抑菌实验显示,化合物5对枯草芽孢杆菌和结核分枝杆菌有较强的抑制作用;同时在构巢曲霉中表达骨架结构基因PKS-NRPS和FAD依赖氧化酶基因,发现了一个新的化合物6,证明FAD依赖氧化酶在此生物合成途径中参与了化合物5的分子结构修饰,化合物6的分子量为329,在226 nm处有较强的紫外吸收。本论文首先对菜豆壳球孢菌的天然产物进行分离,得到了两个已知的天然五肽化合物,说明了传统方法分离天然产物存在化合物复筛率过高的问题。论文的后两章利用生物信息学和分子生物学技术对真菌中的基因组进行挖掘,以激活两个未知的PKS-NRPS沉默基因簇表达,产生了四个新的天然产物,显示了利用基因组挖掘手段研究真菌中的天然产物的可行性和高效性。
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