随着基因组学的快速发展,大量未知功能基因的测序数据引起了广泛关注,许多生物全基因组的成功破译,其基因组学的研究也有了质的突破,故水稻的这些未知功能基因被视为其基因蓝图中不可或缺的部分。目前,在所有真核生物基因组序列中大约有20%-40%编码蛋白的基因属于未知功能基因。为了深入了解水稻的逆境反应机制及发现新的水稻逆境应答基因,我们利用水稻基因芯片Affymetrix(含51279个转录本)分析了水稻籼稻栽培种培矮64S在逆境胁迫下,不同时期中不同器官的表达谱。在众多逆境响应基因中筛选了一个感兴趣的基因作为候选基因,因其无明显结构特征,也无相关报道,所以将其命名为未知功能基因OsUF3(Oryza sativa unknown function)。GEO表达数据分析显示OsUF3主要受干旱和低温诱导。因此,推测该基因为一个新的逆境应答基因。为了进一步验证OsUF3基因在逆境胁迫中的功能,我们分别构建了过表达载体D-163+1300:OsUF3、反义抑制表达载体D-163+1300:OsUF3、GFP载体D-163+1300:OsUF3-GFP及启动子双元表达载体p CAMBIA3301:OsUF3-P,通过农杆菌的介导将这些嵌合基因转入水稻日本晴中,并分别得到了过表达,反向抑制表达、启动子及GFP表达的转基因植株,相关的研究结果如下:1)根据生物信息学分析,OsUF3无内含子;开放阅读框(ORF)558 bp,编码186个氨基酸残基,蛋白质分子量约为43.25 k D,等电点约为4.95。2)OsUF3上游启动子区域分析发现多种与逆境应答相关的顺式作用元件,如:TGACG-mofit、GC-motif、HSE等。3)实时荧光定量结果分析显示,OsUF3的表达量在ABA处理时最低,在干旱处理时最高,而且在Na Cl处理时比较具有规律性,呈现出逐渐升高的趋势,在高温处理下,OsUF3基因的表达量也具有明显的升高。4)利用农杆菌介导D-163+1300:OsUF3-GFP载体在烟草叶片中瞬时表达,结果显示OsUF3定位于细胞核中。5)对纯合OsUF3过表达转基因植株进行逆境处理实验,结果表明OsUF3过表达株系Ox-2对盐和低温较敏感,而对ABA不敏感。6)OsUF3启动子转基因植株GUS活性检测显示,在正常生长条件下,OsUF3的表达情况和对照日本晴相比无明显差异;低温处理6d后OsUF3启动子转基因植株GUS染色后的根系颜色变深(蓝色),而对照组日本晴无明显变化,说明低温条件下OsUF3在根中的表达量上调。7)田间统计数据显示,成熟期的日本晴、OsUF3过表达株系Ox-2和Ox-4的株高分别为91.5、75.5和77cm,日本晴明显高于过表达株系;三者的穗长分别为18.15、17.6和14.83cm,Ox-2和日本晴没有明显差异,而Ox-4明显小于日本晴;穗颈长分别为6.3、2.05和1.53cm,过表达株系的穗颈长与对照组日本晴有明显差异。此外,与对照组相比过表达株系还出现晚熟,籽粒不饱满的表型。本研究中,过表达株系表现出对低温和Na Cl处理较日本晴敏感,后期工作的重心将放在与低温和盐胁迫相关的转录因子上,探索OsUF3在逆境响应方面的作用机理及信号通路。亚细胞定位没能成功在水稻原生质体中定位,后期工作中争取能在水稻细胞中定位来验证该基因是否在水稻中也定位在细胞核,辅证烟草瞬时表达的结果。目前,农艺性状方面观察统计到了田间数据,并发现其与对照间有明显的差异,但这只是T2代一组单一的数据,可能是目的基因过表达引起的,也可能是外部的实验条件造成的,如组培。接下来我们计划观察统计T3及T4代植株,分析其表型是否稳定遗传给子代。另外,我们还计划将有相关表型的T3代与对照日本晴杂交,以确定其性状是过表达还是突变引起的。