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类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种慢性自身免疫性疾病,以滑膜炎为主要病理特征,影响关节软骨和骨骼的侵蚀和破坏。RA成纤维样滑膜细胞（Fibroblast-like synoviocytes,FLS）是病理性增生滑膜主要的细胞类型,其不受限的增殖、积累、迁移和侵袭,是慢性炎症进展并导致关节损伤和破坏的主要原因。活化的RA-FLS能够产生多种炎症介质诱发细胞因子和趋化因子,能高度动员、保留和活化免疫系统细胞,继而导致慢性炎症和进行性关节破坏。激活转录因子3（Activation of transcription factor 3,ATF3）近年来被证实在一些疾病的发生发展中异常表达,并对细胞生长和代谢产生作用。因此,本研究通过生物信息学分析ATF3与RA的联系,探讨ATF3在RA滑膜组织中的表达和对RA-FLS生物学功能的影响,并进一步探究其分子机制。目的:第一部分:通过生物信息学方法探讨ATF3与RA的相关性以及和药物治疗反应、免疫浸润特性的关系。第二部分:验证ATF3在组织中表达及其对细胞生物学功能的影响。第三部分:观察ATF3对CIA小鼠模型临床表现、病理及炎症因子的影响。第四部分:初步探讨ATF3影响RA-FLS进展的分子机制。方法:第一部分:（1）从GEO数据库中选取与RA相关的微阵列,使用WGCNA方法探索GEO数据库,将选取的差异基因集和临床相关模块取交集并确定靶基因。（2）基于数据集分析ATF3与RA临床参数的关联。（3）利用数据集分析ATF3的表达与基因集富集和免疫浸润分析的关系。第二部分:（1）收集RA和健康对照滑膜组织,提取原代RA-FLS。（2）通过HE、免疫组化观察ATF3在滑膜组织里的表达,q RT-PCR和Western Blot再次验证。（3）细胞免疫荧光鉴定RA-FLS细胞,构建Sh-ATF3和ATF3-OE稳转细胞株并验证感染效率。（4）q RT-PCR和Western Blot验证ATF3在RA-FLS中的表达。（5）CCK-8法检测感染后RA-FLS的增殖,流式检测细胞周期、凋亡。（6）Transwell小室观察感染后RA-FLS的迁移和侵袭能力。（7）通过q RT-PCR和ELISA检测炎症因子的分泌与表达。第三部分:（1）构建CIA小鼠模型,包装慢病毒。（2）经膝关节关节腔注射慢病毒,q RT-PCR进行验证。（3）ELISA检测血清炎症因子分泌。（4）HE观察小鼠膝关节病理情况。（5）番红O-固绿观察膝关节软骨侵蚀情况。（6）TUNEL荧光法观察滑膜细胞凋亡情况。第四部分:（1）将敲减ATF3稳转细胞株和敲减对照株进行m RNA测序,利用生物信息方法将差异基因进行KEGG及GO富集分析。（2）通过Western Blot检测蛋白的表达,探讨ATF3在PI3K/AKT/mTOR通路和细胞自噬与RA-FLS的关系。结果:第一部分:（1）下载GSE12021、GSE55235、GSE55457和GSE55584微阵列数据集,合并为GPL96平台数据库。下载GSE48780和GSE77298微阵列数据集,合并为GPL570平台数据库。（2）GO富集分析表明,GPL96平台数据库中的差异基因显著增强了免疫和炎症相关功能。KEGG富集分析显示差异基因均被显著富集到炎症相关途径中,与RA炎症属性相一致。（3）特征热图中显示了GPL570平台数据库中的106个滑膜组织样本（99个RA、7个正常）,GPL96平台数据库中的74个样本（45个RA、29个正常）。（4）GPL570平台的模块-特征相关的热图中显示,ME-greenyellow模块与RA滑膜组织的负相关程度最高。GPL96平台的模块-特征相关的热图中显示,ME-salmon模块与RA样本的负相关程度最高。（5）将GPL570中的ME-greenyellow模块基因和差异表达基因与GPL96中的ME-salmon模块基因和差异表达基因进行交叉,筛选出基因ATF3。（6）ATF3在炎症浸润性滑膜中的表达略高于非炎症滑膜,与DAS-28评分呈正相关关系。予托珠单抗或甲氨蝶呤治疗前,反应良好的RA患者ATF3的表达明显高于反应有限的患者。（7）GPL96平台中单核细胞与活化肥大细胞呈最正相关,B记忆细胞与幼稚B细胞呈最负相关;在GPL570平台中活化的NK细胞与静止的肥大细胞呈最正相关,而静止的肥大细胞与活化的肥大细胞呈最负相关。第二部分:（1）HE染色见RA滑膜组织大量炎性细胞浸润,滑膜细胞增生肥大,免疫组化显示ATF3在RA中高表达的,和疾病活动正相关,和年龄负相关。（2）q RT-PCR和Western Blot结果显示RA滑膜组织中ATF3高表达。（3）细胞免疫荧光鉴定分离培养出的RA-FLS,Vimentin蛋白阳性,CD68阴性。（4）q RT-PCR和Western Blot方法验证Sh-ATF3和ATF3-OE在RA-FLS中的表达。（5）与空病毒对照相比,Sh-ATF3明显抑制RA-FLS的增殖,而ATF3-OE明显促进RA-FLS的增殖。（6）敲减ATF3使RA-FLS细胞周期阻滞在G0/G1期,过表达ATF3使其阻滞在S期和G2/M期的百分比增加。（7）抑制ATF3的表达可使RAFLS的凋亡增加,过表达ATF3则反之。（8）Transwell结果显示敲减ATF3减弱RA-FLS的迁移、侵袭能力,过表达ATF3则反之。（9）q RT-PCR和ELISA检测结果显示,给予TNF-α干预刺激,敲减ATF3降低RA-FLS中IL-1β、IL-6、IL-8分泌和表达,过表达ATF3可以促进IL-1β、IL-6、IL-8分泌和表达。第三部分:（1）CIA小鼠模型关节炎评分明显高于正常组,CIA小鼠膝关节注射慢病毒后,Sh-ATF3组较Sh-Ctrl组的关节炎指数下降。（2）q RT-PCR验证小鼠膝关节滑膜,结果显示相对ATF3 m RNA表达在Sh-ATF3组和Sh-Ctrl组小鼠中比Normal组高,且在Sh-Ctrl组表达高于Sh-ATF3组。（3）Normal组小鼠膝关节结构正常,滑膜表现正常。CIA小鼠软骨表面不光滑,伴滑膜过度形成,大量的炎性细胞浸润,可见血管翳的形成。Sh-ATF3组较Sh-Ctrl组病理评分降低。（4）在CIA小鼠中,Sh-ATF3组与Sh-Ctrl组相比,血清中TNF-α、IL-1β、IL-6表达量明显下降。第四部分:（1）将敲减ATF3稳转细胞株及对照细胞株行m RNA测序,进行生信分析,提示ATF3基因与经典的PI3K-AKT通路密切相关;（2）Western Blot验证ATF3在RA发病中的分子机制,结果显示ATF3可以促进PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表达并逆转细胞自噬。结论:本研究成功鉴定了与RA致病相关的生物标志物ATF3,高表达的ATF3与全身炎症和RA高疾病活动度呈正相关。结合临床组织标本、细胞体外实验、CIA小鼠体内实验及RA-FLS中分子机制研究,发现ATF3在RA和CIA小鼠滑膜中高表达,可以促进RA-FLS的增殖、迁移和侵袭,抑制细胞凋亡,刺激炎症因子的分泌和表达。分子机制初步阐明ATF3可以激活PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白并抑制细胞自噬,进而影响RA的发病。ATF3可能是干预RA治疗的潜在靶点。