研究背景和目的糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是一种严重危害和威胁人类健康的慢性病,涉及并损害肾脏在内的全身多个靶器官,具有高度的致死率和致残率。糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病患者最重要的合并症之一,它的临床特点是出现微量白蛋白尿,随后出现血肌酐和尿素氮水平的升高,肾功能受到损害,最终出现肾衰竭。由于糖尿病肾脏疾病存在复杂的生化代谢紊乱,一旦进展到终末肾衰竭期,才对其诊断,在预防和治疗上往往比其他病因肾脏疾病更加困难。目前国内外很多肾脏病实验室诊断糖尿病肾病大多以尿蛋白,尿微量白蛋白,尿素氮,肌酐等作为主要检测指标,但是这些指标难以发现早期肾损伤；作为早期标记物,尿微量白蛋白也存在某些不足之处,与糖尿病肾病的病理改变不全相符。由于微量白蛋白尿并不能完全作为糖尿病肾病的完美指标,因此人们寻求其他比尿微量白蛋白更为敏感的、更特异性的、可以预测糖尿病肾功能损伤的临床和实验室指标。中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(neutrophilge latinase-associated lipocalin, NGAL)又称脂质运载蛋白-2(Lipocalin-2),是一种小分子量分泌性糖蛋白,最初是在激活的嗜中性粒细胞中被发现并提取,当受到损伤性刺激后肾小管上皮细胞就会大量合成并分泌NGAL。大量临床研究和动物实验表明,NGAL在急性和慢性肾脏损害中的有生物学预警作用,可作为诊断急性肾损伤(AKI)的生物学标志之一。血清和尿液的NGAL水平在1型和2型糖尿病肾病患者中尿微量白蛋白升高之前就已显著增加了,并且与肾功能改变密切相关,因此NGAL可作为诊断糖尿病并发肾脏损伤的一个灵敏的指标。脂联素(adiponectin APN)是1995年才发现的由脂肪细胞分泌的一种特异性蛋白质,也称30kDa的脂肪细胞补体相关蛋白(Acrp30),其基因定位于人类染色体3q27区域,全基因扫描时发现人类基因染色体3q27区域存在有2型糖尿病的基因易感位点,因此认为人类脂联素基因与2型糖尿病的发病密切相关。APN作为脂肪组织细胞分泌特异性的因子,与肥胖、代谢综合征,胰岛素抵抗、2型糖尿病等疾病密切相关,它不仅可以提高胰岛素的敏感性,还参与血管内皮细胞损伤的修复,临床实验研究显示糖尿病肾病患者的血清中脂联素浓度水平与早期血管内皮功能关系密切,可作为DN患者早期血管内皮功能障碍的预测指标。本研究检测DN患者血清NGAL和APN的水平,并分析其与尿微量白蛋白/肌酐比值(ACR)和肾小球滤过率(GFR)相关性,探讨二者的临床意义及其与DN发生发展的关系。方法1资料与方法1.1一般资料按照1999年世界卫生组织(WHO)的糖尿病诊断和分型标准,选取2012年12月—2013年6月在我院治疗的2型糖尿病(T2DM)患者71例。根据ACR分为正常白蛋白尿组(NA组)27例：ACR<30mg/g·Cr,其中男14例,女13例,平均年龄(41±10)岁；微量白蛋白尿组(MA)23例：ACR为30～300mg/g·Cr,其中男10例,女13例,平均年龄(40±9)岁；临床白蛋白尿组(CA)21例：ACR>300mg/g·Cr,其中男11例,女10例,平均年龄(45±12)岁。选取非糖尿病、非肾脏病患者25例为对照组,其中男12例,女13例,平均年龄(36±9)岁。对照组无急慢性肾小球肾炎、糖尿病、肾动脉硬化、狼疮等系统性疾病肾脏损害等。所有研究对象无严重心功能不全、冠心病、肝病、胶原疾病、脑梗死及肺部疾病。1.2方法1.2.1标本采集：血液收集：①抽取清晨空腹状态的受试者静脉血5m1,用乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)抗凝并静置2h；②4℃离心机,1000r/min,离心10min,取上清液；③再次4℃,1800r/min,离心10min,去除血小板后取上清液；④存放于-80℃冰箱保存。尿液收集：①收集受试者晨起清洁中段尿5m1,置于无致热源及内毒素的试管中；②4000r/min,离心5min,取其上清液,置于微量离心管(Eppendrof管)中；③存放于-20℃冰箱中。1.2.2实验方法血清NGAL和APN水平用ELISA法测检,人NGAL和APN的ELISA试剂盒均购自美国R＆D公司,实验方法按试剂盒说明书操作。根据所得标本的吸光度值,计算出各标本相应的NGAL和APN水平。1.2.3方程法计算肾小球滤过率(GFR)Cockcroft-Gault方程：该方程估计的是内生肌酐清除率(CCr),乘以0.84转化为GFR,即CG-GFR=(140-年龄)×体质量/72x血肌酐(女性x0.85)x0.84。1.2.4其他指标的检测同期由本院中心实验室检测4组受试者的血糖、尿白蛋白及肾功能等指标。1.3统计学方法采用SPSS13.0软件对数据进行统计学分析。所有计量资料以(x±s)表示,多组间差异比较采用One-way ANOVA,多个均值间的两两比较采用Dunnett’s T3检验。NGAL和APN分别与ACR和GFR的相关分析采用Pearson直线相关分析及线性回归分析。结果1.对照组和糖尿病组患者的一般临床资料比较对照组患者25例,糖尿病组患者共71例。各组间年龄、性别构成比、体重指数、腰臀比、舒张压的差异均无统计学意义；SBP在正常对照组显著低于糖尿病组三组(P<0.01),收缩压在NA组、MA组、CA组依次增高,其中CA组显著高于NA组；差异有统计学意义(P<0.05)；平均动脉压在正常对照组显著低于MA组、CA组(P<0.01),平均动脉压水平在NA组、MA组、CA组依次增高,但差异均无统计学意义。FPG水平在NA组、MA组、CA组依次增高,但是组间差异无统计学意义；与对照组相比较,差异有统计学意义(P<0.05)；HbA1C在NA组、MA组、CA组依次增高,与对照组相比较,差异有统计学意义(P<0.05)；TG水平在糖尿病组患者显著升高,与对照组相比较,差异有统计学意义(P<0.05)；TC水平在糖尿病组患者升高,MA组、CA组与NA组、NC组相比较,差异有统计学意义(P<0.05),NA组与NC组升高,但差异无统计学意义,MA组和CA组组间差异也无统计学意义。2.对照组和糖尿病各组患者的肾功能指标测定比较2.1各组肾小球滤过率呈动态变化,NA组的GFR最高,为119.4±6.8ml/min,但与NC组对比,差异无统计学意义；MA组和CA组的GFR较NC组和NA组降低,差异有统计学意义(P均<0.05),CA组的GFR较其他3组明显降低,差异有统计学意义(P均<0.05)。2.2各组尿素氮水平随病情加重逐渐升高,CA组最高,为7.8±3.3mmol/L, CA组BUN较其他3组升高,差异有统计学意义。NC组、NA组和MA组3组间BUN差异无统计学意义。2.3各组血肌酐水平随病情加重逐渐升高,MA组和CA组的SCr水平较NC组和NA组明显升高,差异有统计学意义(P均<0.05),NC组和NA组的SCr差异无统计学意义(P>0.05)。CA组的SCr水平较其他3组升高,差异有统计学意义(P均<0.05)。3.正常对照组与糖尿病组患者血清NGAL和APN水平的差异3.1血清NGAL水平随ACR升高而逐渐升高,NA组、MA组和CA组的血清NGAL水平均较对照组升高,差异均有统计学意义(P均<0.05)；CA组血清NGAL水平较其他3组明显升高,差异有统计学意义(P均<0.05)；MA组较NA组的血清NGAL水平升高,但组间差异无统计学意义(P>0.05)。3.2血清APN水平随ACR升高而逐渐升高,NC组、NA组、MA组、CA组各组间血清APN水平逐渐升高,差异均有统计学意义(P均<0.05)。4.糖尿病患者血清NGAL和APN分别与ACR相关性分析糖尿病患者血清NGAL与ACR呈正相关性(r=0.854,P<0.01),回归方程：Y=180.452+1.201X。血清APN与ACR亦呈正相关性(r=0.828,P<0.01)。回归方程：Y=6.068+0.17X。5.糖尿病患者血清NGAL和APN分别与GFR相关性分析血清NGAL与GFR呈负相关(r=-0.751,P<0.01),回归方程Y=1906.652-14.452X。血清APN与GFR亦呈负相关(r=-0.816,P<0.01)回归方程Y=33.685-2.35X。讨论目前,国际糖尿病联合会(international diabetes federation IDF)统计显示全世界糖尿病患者已经高达3.82亿,糖尿病在全世界范围内的患病率与死亡率已经明显升高,严重威胁到人们的健康生活,世界卫生组织将其定义的4大非传染性疾病之一,成为21世纪以来最严重和最具有挑战性的公共卫生问题之一。糖尿病肾病的临床表现的特点是开始先出现尿微量白蛋白,随后逐渐出现血肌酐和尿素氮水平的升高,最后进入终末期肾脏病,需要透析治疗或肾移植。本研究糖尿病组肾功能指标均有不同程度的损害,血肌酐和尿素氮水平随着病情的加重而逐渐上升,肾小球滤过率在NA组最高,之后MA组、CA组逐渐下降,特别是CA组的GFR较其他各组明显降低。本研究观察到几乎所有的糖尿病肾病患者均伴发高血压,特别是CA组患者血压明显高于其他各组。糖尿病患者的甘油三酯、总胆固醇均显著高于健康对照组,且随着糖尿病肾病进展脂代谢紊乱也呈加重趋势,患者患慢性心脑血管疾病的风险大大增加；脂质代谢紊乱不仅可导致DN患者GFR下降,还是引起尿蛋白增加一个重要因素。本研究观察糖尿病组患者的空腹血糖和餐后2h血糖控制都不是很理想,NA组、MA组、CA组空腹血糖依次升高,但组间并无明显差异,作者推测可能是由于大部分的患者特别是晚期糖尿病肾病患者用药或者注射胰岛素所影响。本研究所观察到测定了不同程度的糖尿病肾病患者血清NGAL水平,糖尿病组患者的血清NGAL明显升高(P<0.05),其中MA组患者血清NGAL水平较NC组和NA组明显升高,且CA组血清NGAL水平达到最高,较其他3组都明显增高(P<0.05),糖尿病患者血清NGAL水平GFR呈负相关(r=-0.751,P<0.01),可以反映肾功能改变；NGAL水平与DN患者UACR呈正相关(r=0.854,P<0.01),一定程度上反映了DN患者肾脏的病理生理进展,可作为监测肾功能损害的实时指标。血清NGAL水平在NA组明显升高,同时血清NGAL与ACR呈正相关性(r=0.854,P<0.01),良好的相关性加上糖尿病肾脏疾病的相似病理进程,NGAL水平在病理性尿微量白蛋白出现之前就已经升高,因此我们可以推论血清NGAL水平可能先于尿微量白蛋白排泄率预测糖尿病肾脏损害。本研究检测了糖尿病患者血清脂联素水平,血清APN水平随ACR升高而逐渐升高,NA组、MA组、CA组各组间血清APN水平逐渐升高,差异均有统计学意义(P均<0.05)；CA组APN水平达到最高,显著高于其他两组和健康对照组(NC组),差异有统计学意义(P<0.05)。本研究2型糖尿病患者血清APN水平随着肾脏损害的进展逐渐升高,对靶器官的保护作用也会逐渐增强,血液循环中脂联素分泌浓度升高加上患者肾小球滤过率下降,使尿液中脂联素浓度水平升高；而血液循环中脂联素浓度升高可能是由脂肪组织细胞合成分泌脂联素增多,这样脂联素可以减轻晚期DN患者微血管病变的损害。糖尿病患者血清APN水平与ACR呈正相关性(r=0.828,P<0.01),血清APN水平与GFR呈负相关(r=-0.816,P<0.01)；因此推论血清脂联素水平与糖尿病肾病患者肾脏功能受损的严重程度相一致,一定程度上可反映DN的发生发展。结论1.DM患者随着蛋白尿程度的增加,血清NGAL和APN的水平升高,且二者均与ACR呈正相关关系,而与GFR呈负相关关系。2.NGAL、APN可能参与了DN的发生与发展,检测血清NGAL、APN有望成为判断DN肾损害程度的指标。