水稻黑条矮缩病毒分子生物学

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以浙江省的水稻黑条矮缩病、河北省的小麦绿矮病和湖北省的玉米粗缩病的病毒分离物为材料,对我国3个病毒分离物进行了系列比较研究。3个病毒分离物粒子大小形态相似,且在血清学上密切相关;三者的介体、寄主相同,并引起相同的症状。提纯3个病毒分离物的基因组片段,凝胶电泳显示它们相应的基因组片段之间大小极其相似,推测3个病毒分离物可能是同一种病毒。然后根据水稻黑条矮缩病毒(rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)日本分离物的S10设计一对引物,利用RT-PCR技术,以3个中国分离物基因组片段S10为模板,均特异扩增到预期大小的片段。克隆3个中国分离物基因组片段S10并测定其全序列,比较分析发现:3个中国分离物基因组片段S10相应部分之间的核苷酸同源性为97.9%~98.9%,和日本RBSDV分离物基因组片段S10的相应部分核苷酸同源性为92.8%~93.1%,和意大利的玉米粗缩病毒(maize roughdwarf virus,MRDV)基因组片段S10相应部分的核苷酸同源性分别为87.6%~88.3%,因此,3个中国分离物都应该是RBSDV,而不是MRDV;也就是说中国不同地区发生的水稻黑条矮缩病、玉米粗缩病和小麦绿矮病都是由RBSDV引起的。 紧接着在克隆基因组片段S10中间部分序列的基础上,采取了一种基于RT-PCR技术的简便方法克隆了河北分离物基因组片段S7~S10、浙江分离物的S7~S10以及湖北分离物的S9~S10,并测定了它们的全序列,EMBL/DDBJ/GenBank数据库的登录号分别为AJ297427(RBSDV-Zj S7)、AJ297431(RBSDV-Zj S8)、AJ297430(RBSDV-Zj S9)、AJ297433(RBSDV-Zj S10)、AJ297428(RBSDV-Heb S7)、AJ297432(RBSDV-Heb S8)、AJ297429(RBSDV-Heb S9)、AJ297434(RBSDV-Heb S10)、AJ291706(RBSDV-HubS9)、AJ291707(RBSDV-Hub S10)。3个中国RBSDV之间的同源性最高(核苷酸同源性94.0%~99.0%,氨基酸同源性96.3%~100%),与RBSDV-Jap的同源性次之(核苷酸同源性90.0%~94.9%,氨基酸同源性91.1%~98.6%),与意大利MRDV的同源性较低(核苷酸同源性85.1%~88.1%,氨基酸同源性85.5%~94.3%)。进一步明确了在中国发生的小麦绿矮病、玉米粗缩病、水稻黑 浙江大学博士论文条矮缩病都是由RBSDV引起的。序列比较发现各个RBSDV分离物及意大利*p V之间的核皆酸变异主要是同类碱基的转换,即OA或CT:而且大多数变异发生在密码子的第三位碱基上,不引起蛋白质水平上的变化。在氨基酸水平上,也多是同类氨基酸的替代,仅有RBSDV·Heb S7 ORFI的。161处存在一个*缺失。3个中国分离物的S7-S10的GC含量、编码区和非编码区的长度、末端保守序列。基因组片段特异性倒转重复序列等基因组组织结构上与RB**(挪、意大利*RD V基本一致;进一步以幻-810编码的相应蛋白质作进化树分析表明 A4mV和 RBSDV应该属于同一种病毒,而且几种 nSDV分离物和意大利MRDV所在的组中,可形成3簇,其中RBSDV中国分离物、RB SDVJap和M ppV各形成一簇,暗示了h SDV中国分离物、g sDV刁叩。MapV虽然有着共同的起源,但在后来的进化中可能是相互独立进行的。 然后以浙江省水稻黑条矮缩病毒分离物为材料在克隆 S7术 的基础上,又探索了一套简单有效的研究水稻黑条矮缩病毒未知的基因组片段的方法,首次克隆了sSDV基因组片段引-S6,并测定了全序列。这是国际上首次报道的侵染植物的斐济病毒(Fjiviruses)全基因组序列。结果表明:RBSDV基因组共29 141血组成,是至今所报道的呼肠孤病毒科中最大的基因组,至少含有13个开放阅读框bpen reading frame,O肪人序列分析表明基因组片段S!长4501nt,仅一个开放阅读框,编码的蛋白质具有KNA聚合酶的特征性结构域,暗示了它是RBSDV核心粒于的一种次要蛋白,即 RNA依赖性 NA聚合酶(NAdepende川 NA polymerase,Rd即),与其它呼肠孤病毒的 Rd帅相比,尽管同源性很低,但在 RdRp的几个保守区域则是非常保守的;基因组片段 SZ和 S3编码的蛋白分别与FDV(竹广砌e。evipw人NL RVRV(M…皿。m7呷。。。v汀us)的 S3或 S4编码的蛋白同源;基因组片段 S4和 NLRV SZ同源;基因组片段引-S4编码的蛋白还和其它的呼肠孤病毒的相应蛋白享有较低的同源性;而 SS和 S6编码的蛋白尽管与NLRV的SS和 S6编码的蛋白大小比较接近,但检测不到同源性,与EMBL/DDBJ用enBank数据库中的其它病毒基因也无显著的同源性。与已知的NLRV基因组相比,推测至少RBSDV S7和SS的第二个Ony编码的蛋白可能与病毒在水稻中的增殖功能有关。
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