论文部分内容阅读
目的：探讨精氨酸特异性单腺苷二磷酸核糖基化转移酶-1（Arginine-specific mono-ADP-ribosytransferases-1，ART1）对小鼠结肠癌CT26细胞上皮细胞间质转化的影响及可能的分子机制。方法：本实验以CT26细胞ART1高表达组（GFP-ART1组），ART1沉默组（GFP-shART1组）为实验组，CT26细胞未转染组（Un-transfection组），空载体组（GFP-Vector组）为对照组。HE染色观察不同组别细胞形态的改变；Western blot检测检测不同组别Snail1，间质细胞标志蛋白N-cadherin, Vimentin，上皮细胞标志蛋白E-cadherin表达变化；粘附实验、划痕实验、Transwell侵袭实验观察不同组别CT26细胞粘附、迁移、侵袭能力；建立不同组别BALB/C小鼠脾脏移植瘤模型，观察小鼠肝脏转移情况；免疫荧光及Western检测总β-catenin及核内β-catenin表达情况；腺病毒Ad-si-β-catenin转染ART1高表达组CT26细胞，Western blot检测ART1高表达组β-catenin沉默后Snail1，N-cadherin, Vimentin, E-cadherin；Western blot检测不同组别CT26细胞及移植瘤蛋白RhoA、ROCK1、磷酸化AKT、磷酸化GSK-3β等蛋白表达。激光显微共聚焦观察肌动蛋白丝变化及流式细胞术检测F-actin蛋白表达；Y27632、Y294002分别处理未转染组CT26细胞，Western blot检测处理组与未处理组ROCK1、磷酸化AKT两者之间表达变化；Western blot和明胶酶谱分别检测不同组别CT26细胞MMP-9，MMP-2蛋白表达和活性变化。结果：（1）ART1对小鼠结肠癌CT26细胞上皮细胞间质转化和转移潜能的影响：本研究采用细胞HE染色观察ART1高表达组，空载体组，ART1沉默组，未转染组CT26细胞形态变化，结果显示与对照组相比，ART1高表达组CT26细胞极性丧失，发生梭形间质样细胞改变，而ART1沉默组CT26细胞发生多边形或非梭形上皮样细胞改变。采用Western blot检测EMT相关蛋白表达，结果显示与对照组相比，ART1高表达组在CT26细胞及移植瘤细胞蛋白EMT诱导因子Snail1，间质标志蛋白N-cadherin,Vimentin表达显著增加以及上皮标志蛋白E-cadherin表达显著减少，而ART1沉默组出现相反趋势。采用细胞粘附实验、划痕实验、Transwell侵袭实验及小鼠肝转移模型检测不同组别CT26细胞粘附、侵袭、迁移能力及观察小鼠肝转移情况，结果显示与对照组比，ART1高表达组可以显著促进CT26细胞粘附、迁移、侵袭运动能力和显著增加脾脏移植瘤小鼠的肝表面转移结节数和肝脏重量，而ART1沉默组出现相反趋势。（2）ART1对小鼠结肠癌CT26细胞上皮细胞间质转化影响的机制研究：采用免疫荧光和western blot检测β-catenin表达，结果显示β-catenin胞核胞浆都有表达，与对照组相比，ART1高表达组总β-catenin及核内β-catenin都显著增加，而沉默组出现相反趋势（P<0.05）；采用腺病毒Ad-si-β-catenin成功转染高表达组CT26细胞并用western blot检测EMT相关标志蛋白，结果显示ART1高表达组细胞β-catenin沉默后Snail1、N-cadherin, Vimentin表达显著下降，E-cadherin表达显著上升（P<0.05）。采用Western blot检测ART1高表达组，空载体组，ART1沉默组，未转染组CT26细胞磷酸化AKT、GSK-3β表达，结果显示与对照组比较，ART1高表达组在CT26细胞及移植瘤细胞蛋白磷酸化AKT、磷酸化GSK-3β表达增加，沉默组出现相反趋势，采用Y294002处理ART1高表达组CT26细胞，β-catenin表达显著下降，提示ART1通过磷酸化AKT影响β-catenin表达；采用western blot检测不同组别RhoA、ROCK1蛋白表达，结果显示与对照组比较，ART1高表达组在CT26细胞及移植瘤细胞蛋白RhoA、ROCK1蛋白表达显著上升，而沉默组出现相反趋势（P<0.05），并且采用Y27632处理未转染组CT26细胞，ART1表达未见明显变化（P>0.05）；采用Y294002、Y27632分别处理未转染组CT26细胞并用Western blot检测处理组与未处理组ROCK1、磷酸化AKT表达情况，结果显示ROCK1可以促进磷酸化AKT表达增加（P<0.05），但磷酸化AKT受抑制后者ROCK1表达未发生改变（P>0.05）。采用激光显微共聚焦观察肌动蛋白丝变化和流式细胞术检测F-actin蛋白表达，结果显示与对照组比较ART1高表达组肌动蛋白丝多而排列规整，而沉默组肌动蛋白丝则少而紊乱。采用明胶酶谱及Western blot检测不同组别CT26细胞MMP-2、MMP-9蛋白表达及活性检测，结果显示与对照组比较，ART1高表达组MMP-2、MMP-9蛋白表达及活性均显著增加，而沉默后出现相反趋势（P<0.05）。结论：ART1通过激活RhoA/ROCK1通路，改变AKT磷酸化水平，下调GSK-3β活性，使胞浆内β-catenin降解减少，入核β-catenin增加，从而促使EMT诱导因子snail1表达增加，上皮细胞标志蛋白E-cadherin表达减少，间质标志蛋白N-cadherin、Vimentin表达增加，并且促进MMP-2及MMP-9活性及表达增加，影响CT26细胞上皮细胞间质转化，从而实现了CT26细胞侵袭转移能力，提示ART1在结肠癌进展中发挥着重要作用。