目的 1．为明确组织工程骨神经化构建的必要性，首先对骨发生、发育阶段的神经发生和支配意义进行探索性研究。 1)探讨肽能神经在骨发育过程中的发生及与血管发生、骨基质细胞分化的关系； 2)利用免疫、化学神经切除术，从不同角度对神经支配进行干预，观察其对骨发育的影响。 2．其次，围绕神经因素应用于骨组织工程和临床治疗的可行性方面，分别从体外和体内两个层次，对神经营养与骨形成的关系进行讨论。 1)在细胞水平观察神经营养因子(NTFs)对体外培养的骨髓基质干细胞(BMSc)增殖和分化的作用，为神经营养因素应用于骨组织工程种子细胞研究打下基础； 2)在上述研究基础上，在骨折治疗模型上观察NTFs对骨折愈合的影响，进一步证实神经营养对骨形成的作用。 方法 1．连续取14日-21日龄SD胚胎鼠和1～14日的SD新生鼠的下肢或其长骨，按骨组织常规方法制成病理切片，通过HE染色初步确定发育阶段，然后对同期同一组织层面分别进行神经肽Y(NPY)、血管活性肠肽(VIP)，碱性磷酸酶(ALP)及血管内皮生长因子(VEGF)免疫组织化学染色，光镜下定性比较每一发育阶段神经肽的表达与ALP和VEGF表达在时间和空间上的关系。 2．取3日龄SD大鼠20只，2周龄雄性40只，分别按体重配对后随机分入处理组和对照组，3日龄鼠处理组10只，皮下注射抗NGF一2.55抗体(anti一NGF)，2周龄鼠两个处理组各10只，分别皮下注射6-经多巴胺(6一OHDA)或1 92一SaPorin(192)，对照组注射空白稀释液，每2天注射一次，并记录体重变化。处理2周后处死动物，取完整股骨和近侧段坐骨神经。坐骨神经用Loyez法行髓鞘染色，评价神经发育情况。股骨进行发育情况大体测量和生物力学检测。参照处理前后体重变化和坐骨神经发育情况，比较三种化学神经切除术后大鼠长骨发育受到的影响。统计方法:SPSS 10.0配对计量资料的t检验。 3.获得体外培养的SD大鼠长骨BMsc，结合形态学和ALP免疫组化染色予以鉴定。对照组BMsc采用无血清培养基DMEM/F12培养，处理组BMsc则在该培养基中添加不同浓度的BDNF或NGF，MTT法检测两种神经营养因子对BMsc的增殖作用;细胞分化检测则采用细胞超声破碎，底物显色测ALP活性的方法比较。统计方法:SPSS 10.0广义线性模型单变量分析(因子之间比较)。 4.取正常成年SD雄性大鼠42只，按体重配对后随机分入处理组和对照组，所有动物均制备成双侧胫骨中上段横行骨折髓内针固定模型。BDNF处理组12只，NGF处理组9只，术后每2天接受一定剂量的BDNF或NGF皮下注射，在第2周(仅BDNF组)、3周、4周、5周处死动物，对其胫骨骨折愈合进行大体情况和生物力学评价，并对骨折线处骨痴进行扫描电镜观察。力学数据统计方法:SPSS 10.0单因素方差分析(多组均数两两比较)。结果 1.在软骨基质期，骨基质细胞刚刚开始向成骨细胞分化，尚无血管发生的迹象，此时已有VIP的表达，参照第二骨化中心期骨髓区的发育，发现VIP的表达和ALP活性在空间和时间上呈平行关系;在骨发育到一定阶段时(长骨干第一骨化中心期)，VEGF表达出现，此时NPY表达也呈阳性，且定位相同于VEGF。 2.应用神经免疫抑制或化学切除术后，各处理组与对照组之间体重均无统计学差异。 (l)anti一GF处理后，坐骨神经髓鞘染色显示处理组神经轴突髓鞘 3厚度较对照组不均匀，排列不整齐，数量略低于对照组，但无统计学差异俨习.160)。处理组股骨干中段皮质直径较对照组粗(P直径阅.003，P直径长度比月.003)，而最大承受应力接近(尸七0.242)，应力曲线斜率也无差异(产幻.379)，说明两组骨质无差异，提示处理组皮质较薄，这可能是由于发育过程中成骨细胞/破骨细胞系统平衡受到破坏，破骨细胞的功能相对活跃，间接地诱导成骨细胞加速成骨造成皮质骨外径增大。 (2)6一oHDA处理后，坐骨神经翅鞘染色显示两组神经轴突的数目和排列统计学差异印旨0.610)。两组股骨发育大体测量无差异(P直径=0 .7”，尸直社长度比=0.596)，但是最大承受应力和应力曲线斜率两方面处理组均劣于对照组(P过人应力=0.040，P曲线斜率旬.仍4)，提示处理组骨质矿化过程受到影响，骨基质纤维排列不良，这是成骨细胞成骨功能受到抑制的表现。 (3)192处理后，坐骨神经髓鞘染色显示处理组轴突排列整齐程度较对照组差，轴突密度明显低于对照组仔怡0.009)。处理组股骨中段直径细于对照组(尸坛0.005)，而直径长度比接近(尸‘0.073)，说明处理组骨骼发育整体较对照组慢，而且比例均匀。‘处理组在最大承受应力方面低于对照组(户闭.024)，而应力曲线斜率两组无差异沙怡0.3 11)，提示处理组骨成骨细胞增殖速度受到部分影响，但分化与成骨未受明显影响。 3.取材于大鼠下肢长骨骨髓，获得体外培养的BM阮，通过ALP免疫组织化学染色鉴定，确认细胞性质和纯度符合实验要求。培养基中加入不同剂量的BDNF或NGF，在不同时间测细胞增殖和细胞分化情况