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蛋氨酸(Methionine,Met)是家禽第一限制性氨基酸,广泛应用于家禽养殖生产中,在调控机体免疫功能等方面发挥重要作用。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是家禽细菌病原体的主要致病因子之一,能够诱导家禽肠道功能絮乱,并引发机体炎症,严重影响家禽的生产性能。但目前蛋氨酸是否能够有效调节LPS诱导固有免疫机制及其分子机制尚不清楚。因此,本研究通过建立LPS诱导巨噬细胞炎症反应模型,探讨蛋氨酸对LPS诱导巨噬细胞RAW264.7炎症反应的影响,以及从MAPK信号通路和甲基化反应过程来探究其分子机制。1.Met对RAW264.7细胞活性的影响:采用CCK-8法检测不同Met浓度(0.1μM、1μM、10μM、0.1 mM、1 mM、10 mM)对巨噬细胞RAW264.7的活性。结果表明:上述Met浓度处理对RAW264.7细胞的活性无显著影响(p>0.05)。2.筛选Met对LPS诱导RAW264.7炎症的有效浓度:利用Q-PCR技术检测不同Met浓度(0.1μM、1μM、10μM、0.1 mM、1 mM、10 mM)对LPS诱导RAW264.7细胞因子IL-6、TNF-α和IFN-β的相对基因表达量。结果表明:Met浓度为10 mM都能显著抑制LPS诱导RAW264.7细胞因子IL-6、TNF-α、IFN-β的相对基因表达量(p<0.05),则后续试验的蛋氨酸处理浓度为10 mM。3.Met对LPS诱导RAW264.7细胞因子IL-6,TNF-α和IFN-β表达量的影响:试验分为4个组,正常培养RAW264.7细胞为对照组,另外三个实验组是Met组、LPS组和Met+LPS组。用Q-PCR技术和ELISA试剂盒分别从基因水平和蛋白水平上检测蛋氨酸对LPS诱导细胞因子IL-6、TNF-α和IFN-β的表达量。结果表明,在基因水平和蛋白水平上,Met均能显著抑制LPS诱导RAW264.7细胞因子IL-6、TNF-α和IFN-β的表达(p<0.05)。4.Met对LPS诱导RAW264.7细胞MAPK信号通路的影响:试验分为2组,LPS组和Met+LPS组。运用Western blot技术检测LPS诱导MAPK信号通路中亚族蛋白p38、Erk、JNK磷酸化水平。结果表明,Met能显著抑制LPS诱导RAW264.7细胞MAPK信号通路中p38、Erk、JNK磷酸化水平(p<0.05)。5.S-腺苷蛋氨酸(S-Adenosyl methionine,SAM)对LPS诱导RAW264.7中细胞因子IL-6、TNF-α和IFN-β表达量的影响:试验分为4组,正常培养RAW264.7细胞为对照组,其余三个实验组是SAM组、LPS组和SAM+LPS组,从基因和蛋白水平上检测SAM对LPS诱导细胞因子IL-6、TNF-α和IFN-β表达量。结果表明,SAM作为Met的甲基供体,同样在基因和蛋白水平均能显著抑制LPS诱导RAW264.7细胞因子IL-6、TNF-α和IFN-β的表达(p<0.05)。6.SAM对LPS诱导RAW264.7细胞MAPK信号通路的影响:试验分为2组,LPS组和SAM+LPS组。利用Western blot技术检测SAM对LPS诱导MAPK信号通路中亚族蛋白p38、Erk、JNK磷酸化的水平。结果显示,SAM与Met作用效果一致,同样显著抑制LPS诱导MAPK信号通路中p38、Erk、JNK磷酸化水平(p<0.05)。7.Met对LPS诱导RAW264.7细胞自噬蛋白LC3的影响:试验分为4组,对照组为正常培养的RAW264.7细胞,另外三个实验组为Met组、LPS组和Met+LPS组。运用Western blot技术检测LPS诱导RAW264.7细胞的自噬蛋白LC3的表达量和LC3II/I的比值。结果表明,Met能显著抑制LPS诱导RAW264.7细胞自噬蛋白LC3 II/I的表达量(p<0.05)。8.Met和SAM对LPS诱导RAW264.7细胞炎症中全基因组甲基化水平的影响:试验分为6组,分别为Ctr组、Met组、SAM组、LPS组、Met+LPS组、SAM+LPS组。运用MeDIP-Seq技术分析各试验组中巨噬细胞全基因组甲基化水平,并鉴定对比各组之间全基因组差异甲基化基因,进Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)分析。结果表明:Met和SAM均能增加细胞基因内甲基化水平。Met+LPS组较LPS组相比,甲基化下调的基因多于甲基化上调的基因,并通过KEGG分析出有6个差异甲基化基因富集在MAPK信号通路上,表明Met参与了LPS诱导巨噬细胞炎症中MAPK信号通路上甲基化反应;SAM+LPS组较LPS组相比,甲基化下调的基因多于甲基化上调的基因,并且通过KEGG分析出有4个差异甲基化基因富集在MAPK信号通路上,表明SAM同样参与LPS诱导巨噬细胞炎症中MAPK信号通路上甲基化反应。