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第一部分 通过体内、体外实验探讨肺腺癌中EGFR及其下游ERK通路对CXCR4表达的影响 目的:通过特异性干扰siRNA敲低EGFR的表达,探究敲低EGFR对肺腺癌A549细胞中趋化因子受体CXCR4 表达的影响。探究应用ERK通道阻滞剂U-0126和激动剂EGF对肺腺癌A549细胞及裸鼠移植瘤中CXCR4表达及肿瘤细胞侵袭力的影响。 方法: 1将EGFR干扰siRNA转染入肺腺癌A549细胞,应用Real Time–PCR,Western-Blot方法检测EGFR的敲低效应及CXCR4表达水平的变化。 2在肺腺癌A549细胞中分别加入不同浓度梯度10、40、100ng/mL的表皮生长因子EGF,应用Western-Blot方法检测CXCR4蛋白的表达情况。 3将肺腺癌A549细胞分为四组:空白组、EGF组、EGF+U-0126组、U-0126组。药物处理24小时后用Western-Blot方法检测各组CXCR4蛋白表达情况。 4用Transwell小室检测用药24小时后空白组、EGF组、EGF+U-0126组、U-0126组肺腺癌A549细胞的侵袭情况。 5建立肺腺癌裸鼠移植瘤模型,随机分为四组:空白对照组、EGF组、EGF+U-0126组、U-0126组。用药期间测量裸鼠体重和瘤体大小,药物处理后处死裸鼠,剥除瘤体后对肿瘤大小进行测量,运用HE染色方法显微镜下观测肿瘤细胞形态。 6经药物处理后,分别用Western blot方法和免疫组织化学方法检测肺腺癌裸鼠移植瘤瘤体中CXCR4的蛋白表达情况。 结果: 1. EGFRsiRNA对EGFR表达的敲低效应和敲低EGFR后CXCR4表达情况 将EGFRsiRNA-1,siRNA-2,siRNA-3转染入肺腺癌A549细胞后Real Time-PCR检测结果与对照组(EGFRControlsiRNA)比较,EGFRmRNA 表达水平明显降低。Western-Blot检测结果与对照组(EGFR ControlsiRNA)比较蛋白表达水平明显降低,且敲低效率最高的是EGFRsiRNA-1。应用EGFRsiRNA-1敲低EGFR的表达后Real Time-PCR,Western-Blot结果显示CXCR4在mRNA和蛋白水平的表达显著下降。 2. 在肺腺癌A549细胞中加入EGF对CXCR4的表达的影响 肺腺癌A549细胞经不同浓度梯度EGF处理后,Western-Blot结果显示CXCR4的表达对EGF呈浓度依赖性增加。 3. ERK 通道阻滞剂 U-0126 和激活剂 EGF 对肺腺癌 A549 细胞CXCR4蛋白表达的影响 将A549细胞经药物处理后,Western-Blot检测CXCR4蛋白表达量:EGF+U-0126组和U-0126组较空白组和EGF组明显下降,而EGF组则明显高于空白组。 4. Transwell小室检测以上各药物处理组A549细胞的侵袭性 Transwell小室可观察到EGF组的平均迁徙细胞数显著多于空白组。EGF+U-0126组和U-0126组的平均细胞迁徙数均少于对照组和EGF组。 5. 各组裸鼠原位移植瘤体积变化和形态学观察结果 16只裸鼠均成瘤。EGF组、EGF+U-0126组和U-0126组裸鼠肿瘤大小与空白对照组相比有统计学意义(P<0.05)将各组裸鼠移植瘤切片HE染色显微镜下观察形态学结果:裸鼠移植瘤的瘤组织为肺腺癌,癌细胞异型性明显,核大深染,核染色质呈粗颗粒状,细胞形态多样。 6. 免疫组织化学和Western-Blot检测不同药物对肺腺癌裸鼠移植瘤中CXCR4表达的影响 Western-Blot和免疫组织化学检测结果显示EGF组与空白对照组相比CXCR4蛋白表达量明显升高,而EGF+U-0126组和U-0126组较空白对照组和EGF组明显下降。 第二部分 肺腺癌胸水癌细胞EGFR突变状态对肿瘤侵袭,转移等生物学行为的影响 目的:通过免疫细胞化学染色方法检测肺腺癌患者胸水癌细胞EGFR突变状态对CXCR4,Ki67,MDM2,N-Cadherin表达的影响。 方法: 1收集2017年7月-2017年12月河北医科大学第四医院癌检中确诊的肺腺癌患者胸水,经离心沉淀获取细胞沉渣。 2 运用苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining.HE staining)对胸水细胞进行初筛和诊断。 3 运用免疫细胞化学染色方法(Immunocytochemistry ICC)进一步诊断胸水细胞涂片上癌细胞的类型。 4 应用扩增突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS)检测EGFR突变状态,将患者分为EGFR敏感突变组和非突变组。 5 免疫细胞化学染色(ICC)用特异性标记抗体CXCR4,Ki67,MDM2,N-Cadherin检测肺腺癌病人胸水EGFR敏感突变与非突变状态下的生物学特性是否有差异。 结果: 1. HE常规染色初筛胸水细胞良恶性 HE常规染色涂片分别经两位细胞病理学医生初诊,可见丰富的恶性肿瘤细胞,细胞形态多样,核大深染,核染色质呈粗颗粒状,核浆比增大,符合进一步免疫细胞化学染色与ARMS法检测的要求。 2. 免疫细胞化学染色进一步确定胸水性质与类型 用肺腺癌特异性标记抗体TTF-1及NapsinA在细胞学涂片中进行免疫细胞化学染色,均表现为阳性,另加WT-1、Calretinin、CK5/6、p63、CD56、Syn加以鉴别可以进一步诊断患者胸水癌细胞属于肺腺癌。 3. ARMS法检测胸水EGFR突变情况 ARMS法检测肺腺癌胸水共计46例,其中检测出EGFR L858R或19del敏感突变31例,EGFR非突变15例。 4. 运用免疫细胞化学染色方法检测CXCR4,MDM2,Ki67,N-Cad-herin的表达在EGFR敏感突变组和非突变组是否有差异 免疫细胞化学方法检测结果显示CXCR4、Ki67、MDM2、N-Cadherin表达阳性率EGFR敏感突变组明显高于EGFR非突变组。 结论: 1.应用ERK通道阻滞剂U-0126可以抑制EGF上调CXCR4的表达,从而降低肺腺癌细胞的侵袭性,并且可以抑制裸鼠移植瘤的生长。 2.肺腺癌胸水癌细胞EGFR突变状态和肺腺癌增殖、侵袭、转移生物学行为有关。