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番茄红素是一种抗氧化活性较强的天然色素,具有清除自由基、延缓细胞衰老等功能,在预防前列腺癌、肺癌及心血管疾病等方面发挥显著作用,已被广泛应用于食品添加剂、保健食品与化妆品等行业。目前,番茄红素的植物提取法存在提取率低、纯度低、价格昂贵等问题,化学合成法则存在手性基团无法控制、得率低等问题,严重影响番茄红素的高效合成和广泛应用。随着合成生物学和代谢工程技术的发展,利用代谢工程手段改造模式微生物合成番茄红素,构建高效细胞工厂已成为研究热点。当前微生物合成番茄红素等萜类物质的研究主要集中于优化合成途径、提高前体物质的供给。本文以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为宿主,筛选番茄红素合成途径基因来源,构建并改造合成途径,实现了番茄红素在酿酒酵母中的高效合成。主要研究结果如下:(1)建立一种适用于实验室范围的番茄红素快速测定方法。分析番茄红素在5种不同有机溶剂中的吸收图谱,确定最佳检测条件:正己烷作为溶剂、472 nm为检测波长,得到标准曲线Y=0.0703X+0.0082(R2=0.9972,线性区间为0.5-12 mg·L-1)。(2)筛选番茄红素合成途径基因组合,构建并优化合成途径。分别选取不同来源的3种Crt E、4种Crt B和4种Crt I进行组合,得到48个不同的重组菌株。利用上述番茄红素快速测定方法筛选得到一株番茄红素高产菌株,即表达来源于曼地亚红豆杉(Taxus x media,Tm)的Tm Crt E、成团泛菌(Pantoea agglomerans,Pa)的Pa Crt B和三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora,Bt)的Bt Crt I,番茄红素产量达到1.68 mg·L-1(1.33 mg·g-1 DCW)。然后通过r DNA多拷贝整合基因Pa Crt B和Bt Crt I筛选产量较高的菌株,发现9株r DNA多拷贝整合重组菌的番茄红素产量与拷贝数呈正相关,其中20个拷贝的Pa Crt B和Bt Crt I重组菌R17,产量达到1.51 mg·L-1(1.14 mg·g-1 DCW)。为了进一步提高番茄红素的积累,使用强启动子提高Crt E基因表达水平得到菌株G2,番茄红素产量达到6.95 mg·L-1(5.16mg·g-1 DCW),是对照菌株的4.04倍。为了提高前体乙酰辅酶A的供给,敲除菌株G2的YPL062W基因得到菌株Q1,番茄红素产量达到12.32 mg·L-1(6.92 mg·g-1 DCW),比未敲除菌株提高77.3%。同时在YPL062W位点引入构巢曲霉(Aspergillus nidulans)来源的ATP-柠檬酸裂解酶(ATP citrate lyase,ACL)得到菌株Q2,番茄红素产量为11.04 mg·L-1(6.48 mg·g-1 DCW)。(3)在摇瓶水平对培养基及发酵条件进行优化,进一步提高番茄红素的产量。在摇瓶上通过单因素试验和正交试验优化了培养基的组成,最佳培养基组成为:25 g·L-1蔗糖、10 g·L-1酵母粉、25 g·L-1蛋白胨、4 g·L-1硫酸铵、0.05 g·L-1硫酸镁、0.05 g·L-1三水合磷酸氢二钾,15 m L·L-1微量金属溶液和8 m L·L-1维生素溶液,番茄红素产量达到26.17mg·L-1(12.66 mg·g-1 DCW)。在此基础上进一步对培养条件进行优化,确定最佳发酵条件为:接种量初始OD600为0.2、培养基初始p H为7.0、装液量为50 m L(250 m L三角瓶),番茄红素产量达到26.25 mg·L-1,比发酵条件优化前提高了113.1%。