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产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)是引起包括出血性肠炎、溶血性尿毒综合征(HUS)及血小板减少性紫癜(TTP)等人类疾病的重要病原。STEC以携带具有广泛致病性的志贺毒素(Shiga toxin,Stx)为特征,Stx分为Stx1和Stx2,其中Stx2的毒性更强。Stx毒素由Stx噬菌体编码,通过Stx噬菌体溶原介导大肠杆菌毒力增强已成为共识。Stx噬菌体如何突破宿主菌的防御系统有待深入研究,而作为大肠杆菌重要免疫系统之一的CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)-Cas(CRISPR-associated proteins)系统,其对Stx噬菌体溶原感染及超感染的影响以及相互作用的机制尚不清楚,因而阻碍了采取有效措施防控高致病性STEC的产生。大肠杆菌I-E型CRISPR-Cas系统,由于其cas基因被H-NS(heat-stable nucleoid structuring protein)沉默,在正常条件下CRISPR-Cas并不发挥明显的抵御噬菌体感染和外源质粒侵袭的功能。在此类菌株中,只有缺失H-NS基因或者过表达CRISPR-Cas系统,才具有抵抗外源DNA入侵的能力。为探索大肠杆菌CRISPR-Cas系统与Stx噬菌体超感染以及单一和双重溶原的互作机制,有效防控高致病力STEC的产生,本研究聚焦溶原性Stx2噬菌体和大肠杆菌CRISPR-Cas系统,一方面对临床分离的大肠杆菌菌株CRISPR-Cas系统的CRISPR序列多样性进行了广泛分析,了解其序列特征,解析CRISPR间隔序列在细菌进化及毒力因子转移的内在联系,同时对CRISPR序列在细菌分型方面的作用进行探索应用,另一方面,在H-NS缺失介导CRISPR-Cas激活后,其对烈性大肠杆菌噬菌体vB_EcoS_SH2感染及Stx2噬菌体单一溶原和双重溶原的作用机制进行了一系列研究。通过分析CRISPR-Cas系统在Stx噬菌体超感染过程中所发挥的作用,确定Stx噬菌体多重溶原与宿主CRISPR-Cas系统的相关性,从分子水平阐明两者之间的互作机制。为了探究大肠杆菌CRISPR-Cas系统的CRISPR序列多样性,对大肠杆菌K-12及O157部分菌株进行CRISPR位点的PCR筛选及序列扩增,菌株中均存在CRISPR序列,且存在两个甚至多个,不同CRISPR的重复序列和间隔序列在碱基个数及序列上存在差异。此外,对临床分离的80株禽致病性大肠杆菌菌株的CRISPR位点也进行了序列扩增、测序,及根据其间隔序列特征进行了分类,综合禽致病性大肠杆菌菌株毒力因子分布的结果,对CRISPR与大肠杆菌毒力因子水平基因转移导致菌株致病性差异之间的关系进行了相关研究。通过对52株APEC(avian pathogenic E.coli)菌株和28株AFEC(avian fecal commensal E.coli)菌株的CRISPR间隔序列分析后发现,其间隔序列的个数与其菌株毒力因子分布及致病力有关。APEC作为致病菌株,其CRISPR序列中含有更多的间隔序列,表明这些菌株在基因水平转移过程中获得了更多的外源基因,相应的可能提高了其获得毒力因子的机会,间隔序列的个数与毒力因子分布及菌株潜在致病力之间存在着一种正相关的关系,同时,根据间隔序列的差异,可将80株禽大肠杆菌分离株分成9个群簇,有助于大肠杆菌在原有分型基础上更准确分型。在大肠杆菌中广泛存在的CRISPR序列及相应的CRISPR-Cas系统,是否存在抵御噬菌体感染及外源DNA入侵的适应性免疫功能?为揭示这一问题,以大肠杆菌K-12菌株为对象,通过Red重组系统构建H-NS基因缺失株以激活CRISPR-Cas功能,发现hns缺失导致细菌cas基因转录水平明显上调,hns缺失株能抵抗外源质粒入侵及抑制ΦMin27噬菌体溶原及裂解感染,但CRISPR序列并未发现新的间隔序列整合,表明hns缺失诱导CRISPR-Cas激活,从而发挥抑制噬菌体感染及外源质粒入侵功能。为研究大肠杆菌CRISPR-Cas系统对Stx2噬菌体溶原株的作用,通过溶原模型以及构建突变ΦMin27噬菌体,并构建重组CRISPR质粒,进行相关研究发现,hns缺失介导激活的CRISPR-Cas可能参与调控细菌群体行为,抑制hns缺失溶原株的爬行运动能力并显著抑制溶原株的生物被膜形成,且能有效抑制噬菌体ΦMin27溶原和裂解感染,与对照菌株相比,噬菌体在携带ΦMin27噬菌体间隔序列的hns缺失株中增殖滴度降低约100倍;其噬菌体溶原株在丝裂霉素C诱导后的子代噬菌体释放也受到抑制,噬菌体滴度下降约2个数量级。间隔序列匹配介导的CRISPR-Cas系统能针对溶原株,导致其子代噬菌体释放较对照菌株低100倍左右,且其毒素产生水平也受到明显影响,引起更少的Vero细胞死亡,Western blot结果显示其毒素蛋白表达水平明显降低,表明CRISPR-Cas系统影响着Stx2噬菌体溶原株的生物学特性。为了探索不同噬菌体与CRISPR-Cas系统的互作关系,同时丰富噬菌体库,分离并鉴定了一株强裂解性大肠杆菌T1样噬菌体vB_EcoS_SH2,其噬菌斑呈圆形、大而透明、边缘整齐。电镜观察SH2的头部呈二十面体立体对称,尾部较长。噬菌体的潜伏期为10 min、爆发期为60 min、裂解量高达121,其最佳感染复数为0.01。基因组测序和比对结果表明,SH2的核酸类型为dsDNA,基因组全长为49,088bp,G+C%含量为45%,GenBank登录号为KY985004,结合电镜观察及BLASTp分析,确定其属于有尾噬菌体目,长尾噬菌体科成员。通过构建针对SH2噬菌体的重组CRISPR序列及携带该序列的相关菌株,发现烈性噬菌体SH2的感染也被CRISPR-Cas抑制,细菌存活率更高,且细菌在不同密度条件下,介导CRISPR-Cas对噬菌体感染呈现不同的抵抗力。为了研究CRISPR-Cas系统与Stx2噬菌体ΦMin27双重溶原株之间的分子作用机制,利用构建的重组噬菌体ΦMin27(ΔStx::Cat),成功获得双重溶原株,噬菌体均整合至wrbA位点。与单一溶原株相比,双重溶原株在hns缺失后,其cas基因转录水平显著上调,携带ΦMin27噬菌体间隔序列的双重溶原株在诱导后其噬菌体释放及毒素表达水平受到明显抑制,双重溶原株溶原裂解相关调控基因CI,CII和Cro转录水平动态变化提示CRISPR-Cas可能通过影响溶原裂解调控机制来影响溶原株生物学特性;此外,Cas3的过表达能明显抑制ΦMin27噬菌体的裂解增殖,噬菌体滴度下降约5个数量级,而在cas3缺失状态下,细菌对噬菌体感染无明显抑制作用,表明Cas3过表达能增强CRISPR-Cas系统抵御外源噬菌体感染的能力,介导更强的适应性免疫功能。综上所述,本文系统研究了大肠杆菌CRISPR-Cas系统序列多样性及其与Stx2噬菌体溶原的分子作用机制,基于hns缺失介导的CRISPR-Cas系统激活,阐明其通过间隔序列匹配靶向ΦMin27噬菌体单一及双重溶原株的作用机制,CRISPR-Cas的适应性免疫功能对Stx2噬菌体溶原菌株毒素分泌产生的影响将为STEC的防控提供新的思路。