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【研究目的】利用锰中毒大鼠模型,观察人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)移植至脑纹状体后,向多巴胺能神经元分化情况及相关蛋白的表达,以期观察hBMSCs移植的治疗作用及可能机制。【研究方法】1.选择SPF级雄性SD大鼠70只,用MnCl2·4H2O 0.2 mg/100g腹腔注射染毒,制做锰中毒大鼠模型。根据大鼠肌张力、平衡木、行为学、水迷宫逃避潜伏期、水迷宫平台搜索次数等评分,综合建立锰中毒模型[1],筛选出40只锰中毒模型。将锰中毒模型随机分为实验组(B组)和对照组(P组),每组各20只。B组给予hBMSCs大鼠脑纹状体内移植,同样方法P组仅给予PBS。移植后大鼠的观察期分为1、2、3、4月,根据观察期,再将B组大鼠分为B1、B2、B3、B4四个亚组,P组分为P1、P2、P3、P4亚组,每组大鼠5只。观察期末检测大鼠各项观察指标。2.将人骨髓细胞置于DMEM(Gibco)的维持培养基中,培养至第三代骨髓间充质干细胞(hBMSCs)。通过流式细胞术鉴定hBMSCs的表型。3.参照脑立体定位图谱确定大鼠纹状体坐标(AP=-0.24 mm,L=-0.40 mm,V=-0.55 mm),将hBMSCs/PBS移植至锰中毒大鼠纹状体内。4.移植后每日观察大鼠行为变化,分别在移植后1、2、3、4月末检测实验组和对照组每只大鼠的肌张力,实验组和对照组各取两只大鼠制作脑组织冰冻切片,在免疫荧光显微镜下观察NeuN/hNUC、TH/hNUC、VMAT2/hNUC染色。每组剩余的三只大鼠,麻醉后迅速分离出纹状体组织,通过Western Blot检测每只大鼠脑纹状体中NeuN、TH、VMAT2、BDNF的蛋白含量,使用ELISA检测大鼠纹状体中DA、GDNF含量。【研究结果】1.电镜下可以看到移植前染毒大鼠纹状体内神经元周围水肿,核变小、固缩、染色质聚集。神经元内可见多处蛋白质聚集,并且部分蛋白质聚集物与溶酶体融合,髓鞘内神经丝聚集。移植后实验组纹状体神经元核膜呈现椭圆形,与移植前相比构造较完整,蛋白质聚集现象较少,髓鞘内神经丝聚集少,对照组同移植前差异不明显,这说明hBMSCs移植后可减缓纹状体神经元蛋白聚集的病变。2.肌张力变化:方差分析,移植前实验组与对照组各亚组肌张力增高分值比较无显著性差异(F=0.255,P>0.05),移植后实验组的肌张力增高分值显著低于对照组(t=2.568,P<0.05),移植后4个月差异较明显(t=2.351,P<0.05)。两组自身对照比较,对照组移植前后肌张力分值明显增高(t=4.806、P<0.01),而实验组移植前后肌张力增高分值变化没有显著性差异(t=1.614,P>0.05),说明脑纹状体干细胞移植可能有减缓锰中毒大鼠肌张力增高进展的趋势。3.hBMSCs向多巴胺能神经元分化印迹(1)NeuN/hNUC双标荧光分析:hNUC特异性标记hBMSCs,NeuN特异性标记成熟神经元,荧光显微镜分析。实验组大鼠脑切片显示存在NeuN/hNUC双标阳性的细胞,对照组中未见NeuN/hNUC双标阳性细胞。对照组可以观察到NeuN标记的阳性细胞,但是较实验组少,说明hBMSCs可分化为成熟神经元。对比观察1至4月实验组大鼠脑切片B3 NeuN/hNUC双标细胞数量较多,B4又见减少,说明hBMSCs分化而来的神经元大部分在3个月时成熟,以后逐渐减少。(2)TH/hNUC双标荧光分析:TH是多巴胺能神经元特异性标记物,实验组大鼠脑切片显示存在TH/hNUC双标阳性的细胞,对照组中未见TH/hNUC双标阳性的细胞,可以观察到TH标记的阳性细胞,但是较实验组少。说明hBMSCs可分化为多巴胺能神经元。(3)VMAT2/hNUC双标荧光分析:多巴胺能神经元成熟后,II型囊泡单胺转运蛋白(VMAT2)开始表达,实验组大鼠脑切片显示存在VMAT2/hNUC双标阳性的细胞,对照组中未见VMAT2/hNUC双标阳性的细胞,可以观察到VMAT2标记的阳性细胞,但是较实验组少。(4)NeuN蛋白含量测定:实验组与对照组进行统计学分析,实验组NeuN蛋白含量明显高于对照组(t=2.743,P<0.01),表明实验组成熟神经元含量高于对照组。各时间点实验组与对照组相比无明显差异(P>0.05)。实验组NeuN蛋白含量在移植后的1至3月依次递增,第3月时达到高峰,然后逐渐下降。4个月内实验组大鼠纹状体内NeuN蛋白含量无明显差异(F=0.074,P>0.05),对照组大鼠纹状体内NeuN蛋白含量也无明显差异(F=0.844,P>0.05)。说明随时间推移大部分由hBMSCs分化而来的神经元逐渐分化成熟。(5)TH蛋白含量测定:实验组与对照组进行统计学分析,结果显示实验组TH蛋白含量明显高于对照组,有显著性差异(t=2.229,P<0.05),表明实验组多巴胺能神经元含量明显高于对照组。移植后第一个月实验组TH蛋白明显高于对照组,有显著性差异(t=5.757,P<0.01),说明移植后第一个月时实验组大鼠纹状体内酪氨酸羟化酶含量明显高于对照组,其他时间点与对照组相比无明显差异(P>0.05)。实验组TH蛋白含量4个月内无显著性差异(F=0.515,P>0.05),对照组也无显著性差异(F=0.095,P>0.05)。说明hBMSCs可分化为多巴胺能神经元,分化过程可能受其他因素如神经营养因子的调控。(6)VMAT2蛋白含量测定:实验组与对照组进行统计学分析,结果显示实验组VMAT2蛋白含量明显高于对照组,有显著性差异(t=2.102,P<0.05),移植后第一个月实验组与对照组进行统计学分析,结果显示实验组大鼠纹状体中VMAT2蛋白明显高于对照组,有显著性差异(t=4.233,P<0.01),其他时间点与对照组相比未见明显差异(P>0.05)。4个月内实验组内部大鼠纹状体VMAT2蛋白含量无显著性差异(F=0.512,P>0.05)。(7)BDNF蛋白含量测定:实验组与对照组进行统计学分析,结果显示移植后第1个月实验组大鼠纹状体中BDNF蛋白明显高于对照组,有显著性差异(t=6.036,P<0.01)。实验组、对照组大鼠纹状体BDNF蛋白含量在1月至4月均呈先下降后增高趋势。说明hBMSCs能够分泌BDNF,BDNF可能以自分泌方式调控多巴胺能神经元分化和生长。(8)GDNF蛋白含量测定:实验组与对照组进行统计学分析,结果显示实验组GDNF蛋白含量高于对照组,无显著性差异(t=1.626,P>0.05)。(9)DA蛋白含量测定:实验组与对照组进行统计学分析,结果显示实验组多巴胺含量明显高于对照组,有显著性差异(t=2.109,P<0.05)。实验组多巴胺含量在移植后1至4月依次降低。4个月内,实验组内部大鼠纹状体内多巴胺含量在无明显差异(F=1.675,P>0.05),对照组内部大鼠纹状体内多巴胺含量无明显差异(F=1.491,P>0.05)。说明hBMSCs分化的多巴胺能神经元可分泌多巴胺,提高纹状体内多巴胺含量,其分泌可能受神经营养因子的调控。(10)用Pearson相关分析DA与TH、VMAT2、NeuN、BDNF、GDNF之间的相关性,结果示DA与TH相关(r=0.488,P<0.05),TH与BDNF有相关(r=0.517,P<0.05),VMAT2与NeuN有相关(r=0.726,P<0.05)。其他指标之间无相关(P>0.05)。对有相关性的指标之间进行偏相关分析,结果显示去除其他指标的影响后,DA与TH仍有相关(r=0.583,P<0.05),TH与BDNF仍有相关(r=0.581,P<0.05),VMAT2与NeuN仍有相关(r=0.774,P<0.05)。【研究结论】本实验观察到hBMSCs可减缓锰中毒大鼠肌张力增高进展的趋势,能够减缓纹状体神经元蛋白聚集的病变趋势。hBMSCs纹状体移植后可分化为多巴胺能神经元,纹状体内多巴胺含量增高。表明hBMSCs对锰中毒大鼠有一定的治疗作用。