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肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)(简称肝癌)是全球发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤之一,在我国每年新诊断的肝癌约占全世界的55%,其死亡率在我国恶性肿瘤中位列第二位。肝星状细胞(Hepatic stellate cells, HSCs)是肝脏重要的间质细胞,当肝脏受到病毒感染等病理因素刺激时,肝星状细胞活化分泌胶原蛋白等细胞外基质,参与肝脏纤维化过程。近年来研究发现,肝癌细胞可诱导肝星状细胞活化,活化后的肝星状细胞分泌多种基质和细胞因子,参与肿瘤微环境的形成和重塑,进而促进肝脏肿瘤进展。FK506结合蛋白65 (FKBP65)位于内质网上,参与多种胶原蛋白及弹性蛋白的翻译后修饰及转运,且与多种肿瘤进展预后相关。本文旨在研究FKBP65在肝细胞肝癌组织内活化肝星状细胞中的表达及其在肝细胞肝癌侵袭转移中的作用。第一部分FKBP65在肝细胞肝癌组织中的表达及临床意义目的：研究FKBP65在肝癌组织中的表达及其与肝癌临床病理特征和预后关系。方法：应用免疫组化方法检测147例肝细胞肝癌组织构建的组织芯片中FKBP65 a-SMA蛋白表达情况,SPSS 19.0统计分析FKBP65表达与肝细胞肝癌临床病理特征及预后的关系以及FKBP65与a-SMA间相关性。结果：FKBP65主要表达在肝癌组织间质中成纤维样细胞胞质中。肝癌组织中FKBP65蛋白的高表达与肝癌患者高ALT水平和大肿瘤直径等临床病理因素有明显关联(P<0.05)。Kaplan-Meier单因素分析表明,FKBP65高表达组总体生存率及无复发生存率明显低于FKBP65低表达组(P=0.052, P=0.023)。Pearson Correlation分析表明,肝癌组织中FKBP65和a-SMA的表达密切相关(P<0.001,r=0.288)。结论：FKBP65在肝癌组织中高表达与肝癌患者不良预后相关,FKBP65主要表达在肝癌组织内活化肝星状细胞中。第二部分FKBP65在活化肝星状细胞促进肝细胞肝癌侵袭转移中的作用及相关机制研究目的：研究FKBP65在活化肝星状细胞中表达及其在活化肝星状细胞促进肝细胞肝癌侵袭转移中的作用及相关机制。方法：应用Western blot方法检测FKBP65在不同肝癌细胞系、不同肝星状细胞(系)中表达情况,免疫荧光方法检测FKBP65在活化肝星状细胞(HHSteCs)中表达。应用体外二维共培养体系使活化肝星状细胞分泌上清作用肝癌细胞(MHCC97H和HepG2),应用以慢病毒为载体的siRNA对活化肝星状细胞HHSteCs中FKBP65进行mRNA水平上基因沉默。分别用相差显微镜观察、侵袭实验、Western blot及RT-PCR检测共培养后肿瘤细胞形态、功能变化及转移潜能相关分子的表达情况。应用电镜观察下调FKBP65表达后HHSteCs的超显微结构变化,应用Western blot及ELISA检测下调FKBP65表达后HHSteCs胞内及分泌上清中Ⅰ型前胶原含量的变化。结果：FKBP65主要表达在活化肝星状细胞胞质中。与HHSteCs共培养后,肝癌细胞(MHCC97H和HepG2)均呈细长梭形变化,侵袭能力增强,E-钙黏蛋白下调,波形蛋白、MMP2、MMP9、VEGFA、VEGFB上调；与低表达FKBP65的HHSteCs共培养后,肝癌细胞(MHCC97H和HepG2)上述改变减弱。观察下调FKBP65表达后的HHSteCs胞内超显微结构,细胞膜下见团块状聚集物;Western blot及ELISA分别检测到下调FKBP65表达后的HHSteCs胞内Ⅰ型前胶原增多,分泌上清中Ⅰ型前胶原减少。结论：FKBP65在活化肝星状细胞胞质中表达：活化肝星状细胞对肝癌细胞侵袭转移潜能有促进作用,下调活化肝星状细胞中FKBP65的表达可减弱这一促进作用；下调FKBP65表达可干扰活化肝星状细胞内Ⅰ型前胶原等影响肝癌进展的蛋白的分泌。创新点1.首次发现FKBP65在肝癌组织中表达与肝癌预后有密切关系。2.首次发现FKBP65在活化肝星状细胞中表达,并发现其在活化肝星状细胞对肝癌细胞侵袭转移潜能的促进作用中发挥重要作用。潜在应用价值1. FKBP65是一个潜在的牵涉于肝癌微环境促肿瘤转移复发的治疗靶点。2.为深入研究活化肝星状细胞促肝癌细胞侵袭转移潜能的具体机制提供实验基础。