喉癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，每年发病率约占全身恶性肿瘤2-3％。在我国东北地区，喉癌的发病率明显高于全国其他地区。喉癌中有93-97％为鳞状细胞癌。尽管多年来外科手术和放化疗技术有了明显进步，但喉癌患者的愈后并没有明显改善，5年生存率仅有60-70％左右，最常见的死因为局部淋巴结转移或者远隔转移，因而对于喉癌侵袭转移的机制的研究具有重要的科学价值和实际意义，将可以用于愈后评估、筛查诊断和靶向治疗等多个方面。　　 microRNA(miRNAs)是长度18-25个核苷酸的小分子非编码RNA，在生物进化过程中高度保守。针对miRNA的研究表明，在细胞核中drosha（RNaseⅢ酶的一种）把基因组DNA剪切成为小片段(pri-miRNA)，再形成发卡状的双链RNA前体结构(pre-miRNA);在胞浆中，Dicer（RNaseⅢ酶的一种）可以把pre-miRNA剪切成为双链microRNA，双链microRNA解旋后一条降解，另一条成为成熟microRNA;成熟的microRNA可以和mRNA的3’端的非翻译区形成互补结合，进而调节其目的基因的表达，从而在生理病理过程中起到作用，参与发育、增殖、分化、凋亡等多种生物学行为。根据Berezikov等人的计算机模拟预测，在人类基因组中可能存在超过1000种microRNA，而且每种microRNA可能调控多达200种下游靶基因。microRNAs参与各种细胞的分化、增殖和凋亡等生理和病理过程，特别是在肿瘤细胞中发挥着重要的调节作用，异常表达的microRNA可以引起肿瘤中相关基因的异常表达，已发现大约有50％的microRNA定位于与肿瘤相关的脆性位点，其中一些microRNA与肿瘤的生长转移等行为表现出正相关，被认为具有癌基因的作用，相反一些microRNA与中路的生长转移等行为表现出负相关，被认为具有抑癌基因的作用。对microRNA的研究在肿瘤的研究中有着非常重要的意义:有助于阐明肿瘤的发生发展机制;寻找敏感性和特异性高的miRNA用于肿瘤的早期诊断;由于microRNA表达变化可以改变下游很多目的基因的表达，所以针对miRNA的靶向治疗在肿瘤的分子治疗中有广泛的应用前途。　　 对于头颈肿瘤与microRNA关系的研究目前还处于起步阶段，还需要更多更深的了解。目前很多研究表明miR-126是多种肿瘤生长、侵袭和转移的抑制因子，可以通过PI3K/Akt途径抑制非小细胞肺、结肠癌的增殖;通过调节IRS1抑制乳腺癌的增殖;miR-126抑制SLC7A5的表达延长小细胞肺癌的G1期从而抑制其增殖;通过调节Crk抑制胃癌的生长和转移。　　 本课题组采用实时定量PCR技术在临床喉癌标本和喉黏膜标本中检测miR-126的表达差异，然后通过体外细胞模型研究miR-126对喉癌细胞多种生物学行为的影响，利用互联网软件预测miR-126的下游靶基因并进行双荧光素酶活性测定验证。本课题的研究结果将帮助我们了解miR-126对喉癌的作用及机制，为喉癌的诊断提供新的线索，为喉癌的治疗提供新的分子靶点。　　 材料和方法　　 1、临床样本的收集原发喉癌患者来自中国医科大学附属盛京医院耳鼻咽喉科，术前均经病理诊断为喉鳞状细胞癌，术前均未接受放化疗。在喉癌手术过程中收集喉癌组织及部分配对的远端正常喉黏膜组织，标本收集后迅速保存在液氮中备用。　　 2、细胞培养本研究选用的人喉鳞状细胞癌细胞株Hep-2购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。Hep-2细胞培养在含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，于5％C02，37℃培养箱中培养。　　 3、细胞转染miR-126mimics和miRNA-control由锐博生物（中国）公司设计合成，采用脂质体法，应用Lipofectamine2000(Invitrogen，美国)转染试剂进行转染。　　 4、实时定量PCR法检测组织标本中miR-126的表达喉癌组织、癌旁正常喉黏膜组织分别用miRNA Isolation Kit(Axygen，美国)提取microRNA，然后用Reverse Transcription Kit(Takara，日本)进行反转录，SYBR Premix Ex Taq(Takara，日本)进行定量实时PCR检测。　　 5、Western blot半定量法检测HOXA9在组织标本和细胞中的表达Hep-2细胞按常规方法提取总蛋白，进行蛋白定量后，进行Western blot，结果应用Gel-proAnalyzer软件进行半定量分析。　　 6、CCK-8法检测细胞活性按照实验设计对接种于96孔板的细胞进行miRNAmimics和microRNA-control转染，在设定的时间点应用CCK-8（Dojindo，日本）检测细胞活性。　　 7、细胞周期测定按照实验设计对接种于6孔板的细胞进行miRNA mimics和microRNA-control转染，在设定的时间点收集贴壁生长的细胞，PI法染色，应用FACScan流式细胞仪检测(BD Biosciences)，CellQuest软件进行结果分析。　　 8、细胞凋亡测定按照实验设计对接种于6孔板的细胞进行miRNA mimics和microRNA-control转染，在设定的时间点收集贴壁生长的细胞，PI及Annexin V染色，应用FACScan流式细胞仪检测(BD Biosciences)，CellQuest软件进行结果分析。　　 9、细胞迁移和侵袭测定按照实验设计对接种于6孔板的细胞进行miRNAmimics和microRNA-control转染，在设定的时间点收集贴壁生长的细胞，按设定浓度接种于Transwell小室内，24小时后计数小室基底膜下室面细胞。　　 10、双荧光素酶活性测定构建HOXA9-WT或HOXA9-Mut质粒，与miRNAmimics和microRNA-control按照实验设计对接种于96孔板的细胞进行共转染，48小时后加入luciferase底物并测定荧光值。　　 11、应用SPSS17.0软件进行统计分析。　　 结果　　 1、通过实时定量PCR检测发现miR-126在喉癌组织中的表达低于其在正常喉黏膜组织中的表达，高分化组的表达低于低分化组，有淋巴结转移组低于无淋巴结转移组。　　 2、我们发现提高miR-126表达后，Hep-2细胞活性降低、细胞周期抑制、细胞的迁移和侵袭抑制，但细胞凋亡未发生改变。　　 3、应用miR-126mimics和microRNA-control对Hep-2细胞转染，提取蛋白进行Western blot检测，发下提高miR-126的表达后，HOXA9蛋白表达降低。同一组组织标本miR-126的表达和HOXA9蛋白的表达呈负相关，进一步通过双荧光素酶活性测定明确HOXA9是miR-126的下游靶点。　　 结论：　　 1、miR-126在喉癌组织中较正常黏膜组织中低表达。　　 2、miR-126可以抑制喉鳞状细胞癌的活性、细胞周期、细胞迁移及侵袭，但对细胞凋亡无影响。　　 3、miR-126通过靶向HOXA9对喉癌起到抑癌作用。