研究背景高亲和力保护性抗体是机体抵抗外来感染的关键,而高亲和力抗体的产生受到一类特殊T细胞亚群-滤泡辅助性T细胞(Follicμlar helper T cells,Tfh)的调控[1]。Tfh细胞功能调控在抗感染免疫、自身免疫性疾病、免疫缺陷等多种疾病的防治中发挥关键作用。一方面,机体发生感染时,Tfh细胞辅助B细胞产生保护性抗体抵抗感染;另一方面,Tfh细胞过度活化则会促进自身抗体产生而导致自身免疫性疾病[2]。因此机体内存在着复杂而精细的调控机制,以保证Tfh细胞的正常发育、分化和功能[3]。Tfh细胞的分化和功能研究是国际上重点关注的领域之一,目前一个尚未完全回答的核心问题是Tfh细胞的分化和发育是如何被调控的。因此,阐明Tfh细胞分化、发育的调控机制,将有助于抗感染性疾病疫苗的研制及自身免疫性疾病的防治。近年研究表明,细胞代谢参与了T细胞的发育与分化,当营养物质运输和利用受到干扰时,会影响辅助T细胞的分化和功能[4,5]。比如限制培养基中的葡萄糖或谷氨酰胺,会抑制幼稚T细胞的活化和随后T细胞增殖[5,6]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK,5-adenosine monophosphate-activated protein kinase)是生物能量代谢调节的关键分子,它主要的特征是能与AMP结合,通过AMP感受细胞能量状态,从而维持真核细胞ATP生成和消耗的平衡[7]。AMPK在调控细胞生长和增殖、建立和稳定细胞极性、调节动物寿命、调控生理节律等方面也起着重要作用[7]。已有的研究证实AMPKa1对T细胞发育和功能具有重要影响,特别是在营养受限的条件下,AMPKa1能促进CD4细胞向辅助性T细胞Th1和Th17分化,在机体受细菌病毒感染时,AMPK能促进效应性T细胞分泌干扰素等细胞因子,抵抗体内细菌病毒的感染[8]。因此,AMPK是T细胞介导特异性免疫的关键调控因子。但是,AMPK是否能调节Tfh细胞的分化和发育还不清楚,其分子机制非常值得进一步研究。二甲双胍应用于临床已有50多年的历史,是目前全球应用最广泛的临床一线降糖药,其良好的单药/联合治疗的疗效和安全性已得到充分证实[9]。多项研究显示[10-12],二甲双胍可激活AMP激活的蛋白激酶(AMPK)通路。二甲双胍是否调控Tfh细胞分化、是否通过激活AMPK达到调控作用,目前尚无研究。因此,本课题以二甲双胍为切入点、探究AMPK对Tfh细胞分化及功能的调控作用。目的1.探究AMPK对滤泡T辅助细胞分化及功能的调控作用。2.探究二甲双胍是否通过抑制氧化磷酸化促进AMPK活化,进而促进Tfh细胞分化。方法1.探究AMPK在体内是否可以调控滤泡辅助T细胞的分化及功能:C57BL/6小鼠(4-8周)获自南方医科大学实验动物中心(广东省广州市),并在南方医科大学(SMU)的SPF条件下饲养。为了产生T细胞依赖性抗体应答,单次腹腔注射抗原免疫小鼠。随机将小鼠分为治疗组和空白对照组,于抗原免疫前7天(即第-7天)开始,治疗组给予AMPK激活剂二甲双胍灌胃防治,对照组给予饮用水灌胃。1.1酶联免疫吸附测定法ELISA:总免疫球蛋白Ig和亚型免疫球蛋白Ig定量通过ELISA测量总Ig和亚型Ig定量。在免疫后第0、7、14天,以菱形针刺破小鼠颌下静脉采血并收集血清。在用NP6-BSA包被的平板上捕获血清样品中IgM和IgG用于高亲和力Ig定量检测或包被NP22-BSA用于总Ig定量检测。通过使用HRP缀合的山羊抗小鼠抗IgM或抗IgG抗体测定OD 450值计算Ig相对水平。1.2流式细胞术以标准化脾脏淋巴细胞分离方案操作,取出小鼠脾脏(Spleen)、肠系膜淋巴结(mLN)和派尔氏淋巴结(PPs,也称为集合淋巴结节),采用200目筛网研磨制备细胞悬液。用红细胞裂解液裂解红细胞后,将细胞重悬于IMDM-10完全培养基中,然后用DAPI,7-AAD,FITC标记的抗CD8,APC-Cy7标记的抗CD4,PE标记的抗PD-1,PE-Cy7标记的抗ICOS,APC标记的抗CXCR5,FITC标记的抗B220,APC标记的抗CD93,APC-Cy7标记的抗IgD,PE-Cy7标记的抗IgM,PE标记的抗Fas,PerCp-Cy5.5标记的抗GL7,FITC标记的抗CD44和PE-Cy7标记的抗CD62L抗体在含有2%FBS的PBS中进行染色。在LSR Fortessa流式细胞仪上获得FACS数据并使用Flowjo软件(版本7.6.2)进行分析。2.探究二甲双胍是否通过抑制氧化磷酸化促进AMPK活化,进而促进Tfh细胞分化:获取初始T淋巴细胞,在趋向Tfh细胞亚型分化的培育条件下诱导其激活,以不同药物加药刺激处理一定时间后,测定其相关指标变化。2.1初始T细胞分离、培养、刺激和分化为了获得初始T细胞,收集脾脏并充足研磨,然后通过用红细胞裂解液裂解红细胞分离纯化淋巴细胞。采用CD4+CD62L+T细胞磁珠分选试剂盒,从C57BL/6小鼠(4-6周)的脾脏中纯化初始T细胞。为了检测初始T细胞的纯度,使用PE标记的抗CD4,FITC标记的抗CD44和PE-Cy7标记的抗CD62L流式抗体孵育细胞样品。将孵育样品放于4℃黑暗环境中染色20分钟,然后通过流式细胞仪测量。2.2实时聚合酶链反应(Real Time qPCR)如前所述,在趋向Tfh细胞亚型分化的培育条件下培养初始T细胞。使用RNAiso Plus提取不同组的总RNA,并使用具有基因组DNA去除剂的RT试剂盒合成cDNA,以上操作均遵循制造商的方案。RT-qPCR反应由QuantStudio5实时PCR系统进行。样品一式两份进行,并使用β-actin作为内参基因。所有PCR引物及其序列如表1所示。2.3蛋白质印迹Western blotting如前所述,将初始T细胞在趋向Tfh细胞亚型分化的培育条件下培养6小时。收获细胞并用补充有蛋白酶抑制剂混合物的预冷裂解缓冲液(50 mM Tris-HCl pH7.5,150mMNaCl,1mMPMSF,1%NP40 和 10U/ml 抑肽酶)裂解20分钟,然后在4℃温度下以12,000rpm离心10分钟。蛋白质样品在SDS-PAGE凝胶上电泳,转移至PVDF膜,以5%脱脂牛奶或牛血清白蛋白(BSA)封闭。随后将条带浸泡于适宜比例的一抗稀释液中,并放置于4℃摇床过夜。本部分使用了针对以下蛋白质的一抗:β-actin,p-AMPK,AMPK及BCL6。用TBST洗涤后,将条带与HRP缀合的IgG二抗(1:10000稀释)一起室温孵育,随后进行化学发光反应,得到结果并使用Gel Pro软件进行分析。结果1.二甲双胍能有效促进滤泡辅助T细胞、生发中心B细胞及抗体滴度水平增长,小鼠脾脏、肠系膜淋巴结及派尔氏淋巴结的PD1+CXCR5+Tfh淋巴细胞、PD1+ICOS+Tfh淋巴细胞和生发中心B淋巴细胞明显增多,免疫后第14天血清中的总IgG、总IgM、高亲和力IgG、高亲和力IgM抗体滴度也明显增高。2.二甲双胍通过抑制氧化磷酸化促进AMPK磷酸化,增强Tfh细胞体外分化,AMPK抑制剂Compound C则能抑制Tfh细胞的体外分化。实验结果显示,二甲双胍能明显上调p-AMPK,Compound C明显下调p-AMPK。3.二甲双胍通过增强转录因子bcl6的表达促进Tfh细胞分化。AMPK直接激活剂AICAR可提高初始T细胞中的bc16转录水平,而AMPK抑制剂Compound C则抑制bc16表达水平。4.采用与二甲双胍同样靶点的抑制氧化磷酸化的试剂鱼藤酮后,Tfh细胞中的bc16转录明显提高。结论1.AMPK的激活能有效促进滤泡辅助T细胞分化和功能。2.二甲双胍通过抑制氧化磷酸化激活AMPK,进而上调转录因子bcl6,促进Tfh细胞分化。