目的:(1)观察中药单体三七总皂苷(PNS)对黑素细胞增殖活性、酪氨酸酶活性、黑素合成、自噬水平的影响。(2)利用高通量测序技术对两种外泌体的miRNA表达谱进行分析。(3)应用角质形成细胞和成纤维细胞释放的外泌体干预黑素细胞,观察两种干预条件下外泌体的内化过程、黑素细胞的增殖情况、酪氨酸酶活性、黑素合成的差异。方法:(1)获取来源于包皮的表皮黑素细胞悬液,传代时进行差别胰酶处理,获得较为纯净的黑素细胞,接种在培养板中。分别用浓度为0μg/ml、10μg/ml、30μg/ml、60μg/ml、90μg/ml、120μg/ml的PNS处理黑素细胞,光镜下观察黑素细胞的生长情况和形态,孵育24小时和48小时分别用多巴氧化法检测酪氨酸酶活性、氢氧化钠法检测黑素含量、CCK-8法检测细胞增殖率。选取中间浓度(60μg/ml),借助自噬水平检测试剂盒检测黑素细胞的自噬水平。(2)培养的角质形成细胞和成纤维细胞用富集法换液,收集培养基,用exo Easy Maxi Kit试剂盒提取培养基中的外泌体,利用高通量测序,分析两种外泌体的miRNA表达谱,主要关注miRNA差异表达分析,对差异表达的miRNAs进行筛选和靶基因预测,并对靶基因进行GO和KEGG富集分析。(3)外泌体用PKH67标记,预先标记的不同来源的外泌体与黑素细胞共培养,48小时后观察黑素细胞的增殖情况、外泌体的内化过程、检测酪氨酸酶活性和黑素含量。结果:(1)原代培养的表皮细胞悬液,黑素细胞、角质形成细胞、成纤维细胞三种细胞混杂,经过差别胰酶处理可以获得较为纯净的黑素细胞。用不同浓度的PNS药液处理黑素细胞,黑素细胞增殖迅速,呈现多树突化。PNS对黑素细胞增殖率、酪氨酸酶活性、黑素含量的促进作用有一定的浓度依赖性,在浓度为60μg/ml时药物的促进作用达到顶峰,并且该浓度处理的黑素细胞自噬体蓝染色呈强阳性。(2)高通量测序分析显示,在两种来源的外泌体中,检测出差异表达的miRNA共有267个,其中表达上调有119个,表达下调有148个。GO分析显示这些差异表达的miRNA的靶基因在分子功能中主要富集在结合蛋白,在细胞组分中主要富集在细胞质、细胞核、质膜、胞液,与细胞生长代谢密切相关。KEGG代谢通路分析显示,差异表达的miRNA调控的靶基因主要参与MAPK信号转导通路、Ras信号途径、Rap1信号通路、c AMP信号通路、细胞内吞、轴突导向、Wnt信号通路、肌动蛋白细胞骨架调节、神经营养因子信号转导通路,肿瘤信号通路等。(3)角质形成细胞和成纤维细胞来源的外泌体,预先用PKH67标记,分别与黑素细胞共培养48小时后,前者在黑素细胞中可以观察到亮绿色的荧光颗粒,而后者没有观察到。角质形成细胞释放的外泌体促进黑素细胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素合成,而成纤维细胞释放的外泌体不具备这种促进作用。结论:(1)PNS对黑素细胞增殖、酪氨酸酶活性、黑素合成具有促进作用,并且呈现一定的浓度依赖性,这种促进作用在浓度60μg/ml时达到峰值。此外,PNS尚能增加黑素细胞的自噬水平。(2)高通量测序分析显示,两种外泌体中差异表达的miRNA共有267个,其中表达上调有119个,表达下调有148个。这些差异表达的miRNAs可能对黑素细胞生物学有影响。(3)角质形成细胞释放的外泌体能被运输到黑素细胞中,并且对细胞增殖、酪氨酸酶活性、黑素合成具有促进作用,而成纤维细胞释放的外泌体不能被黑素细胞内化,对细胞增殖、酪氨酸酶活性、黑素合成没有明显影响。