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背景抑郁症发病率高,易复发,致残率高,现有治疗方式的疗效有限,其发病的分子机制仍然未知。研究表明MKP-1基因在抑郁模型大鼠海马脑区及抑郁症患者体内的表达均上调。近五年来发现microRNAs参与许多靶基因的表达,推测其可能通过调节机体内靶基因的转录表达水平参与抑郁症神经免疫、基因多效性、应激等过程。研究表明let-7a microRNA的靶基因是丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(mitogen-activated protein kinase phosphatase-1,MKP-1)。let-7a是否能够通过调控海马脑区MKP-1基因表达水平参与调控抑郁症的发病过程是本研究探索的科学问题。目的明确let-7a-5p能否通过影响MKP-1及炎性因子水平参与抑郁症的表达过程,进一步了解抑郁症神经免疫紊乱的发生机制。方法将51只180-200g SD雄性大鼠依据前测结果分为正常组、慢性不可预知性应激(Chronic unpredictable mild stress,CUMS)组、空载组、let-7a-5p下调组。采用双荧光素酶基因报告实验验证let-7a microRNA与MKP-1的靶标关系;采用CUMS方法制备抑郁样大鼠模型或用基因工程学方法干扰let-7a的表达,采用糖水偏爱测试、旷场测试、强迫游泳测试评估动物抑郁样行为变化,采用分子生物学技术(Western Blot、qPCR)检测各组大鼠海马区let-7a、MKP-1及炎性因子(IL-6,IL-1β,TNF-α)水平变化。1.实验分组依据前测结果分为正常组、CUMS组;空载体组和let-7a-5p下调组。2.双荧光素酶基因报告实验验证let-7a microRNA与MKP-1的靶标关系。3.模型制备CUMS组进行5周造模。规定每天给予2-3种刺激,所给予的刺激不会连续出现。4.行为学评估四种评估方法:体质量、蔗糖偏爱测试、旷场测试及强迫游泳测试。5.脑立体定位注射空载体组和let-7a-5p下调组在前测评估后,经脑立体定位对腹侧海马CA3区进行微量注射。空载体组和let-7a-5p下调组不给予CUMS造模。6.应用免疫印迹法(Western blot)检测大鼠海马区MKP-1、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、磷酸化细胞外信号调节激酶(phosphorylase extracellular signal-regulated kinase,p-ERK)蛋白表达。应用荧光定量PCR(Quantitative PCR,qPCR)实验检测各组大鼠海马区let-7a和MKP-1水平变化。7.应用qPCR及Western blot验证各组海马组织中各炎性因子(IL-6,IL-1β,TNF-α)的表达变化。8.统计方法使用SPSS 22统计软件分析结果,GraphPad Prism 7软件作图。论文中两组间差异采用student t检验(双侧)分析数据,不服从正态分布则采用U检验。计量资料用均数±标准差()表示。P<0.05表示有统计学差异。结果1.双荧光素酶基因报告实验验证结果rno-let-7a-5p对靶标MKP-1抑制效应为46.65%。2.制备CUMS抑郁模型行为学结果CUMS组模型大鼠较正常组出现体质量下降(t=12.357,p=0.000);糖水偏爱率下降(t=2.599,p=0.016);旷场内活动总距离减少(t=2.409,p=0.024)、直立次数减少(t=2.484,p=0.024)、理毛时间增加(t=-3.624,p=0.001);强迫游泳不动时间延长(t=-3.906,p=0.001)、挣扎时间缩短(t=4.384,p=0.000)的现象。3.检测let-7a、MKP-1、P-ERK/ERK及炎性因子(IL-6,IL-1β,TNF-α)水平结果CUMS组较正常组let-7a表达水平下降且有统计学意义(t=2.216,p=0.043)。MKP-1 mRNA表达水平升高且有统计学意义(t=-2.524,p=0.042)。MKP-1蛋白表达水平升高且有统计学意义(t=-2.359,p=0.028),P-ERK/ERK表达水平下降且有统计学意义(t=2.746,p=0.014)。CUMS组较正常组IL-6 mRNA(t=-2.382,p=0.041)、IL-1βmRNA(t=-2.446,p=0.048)水平升高且有统计学意义,TNF-αmRNA的水平变化不显著(t=-1.313,p=0.218)。CUMS组较正常组IL-1β(t=-2.885,p=0.028)蛋白水平升高,IL-6(t=0.299,p=0.768)、TNF-α(t=-1.029,p=0.315)蛋白水平变化不显著。4.海马区注射let-7a-5p腺相关病毒检测MKP-1、炎性因子(IL-6,IL-1β,TNF-α)水平结果空载组和let-7a-5p下调组行为学上无差异。let-7a-5p下调组较空载组MKP-1mRNA表达水平升高且有统计学意义(t=-3.078,p=0.013)。let-7a-5p下调组较空载组MKP-1蛋白表达水平升高且有统计学意义(t=-4.446,p=0.001)。let-7a-5p下调组较空载组IL-6 mRNA(t=0.592,p=0.570)、IL-1βmRNA(t=-1.798,p=0.127)水平变化不显著,TNF-αmRNA的水平升高且有统计学意义(t=-2.390,p=0.044)。let-7a-5p下调组较空载组IL-6(t=-3.436,p=0.026)、IL-1β(t=-2.495,p=0.034)蛋白水平升高且有统计学意义,TNF-α(t=-0.054,p=0.958)蛋白水平变化不显著。结论1.let-7a对靶标基因MKP-1有抑制作用。2.let-7a-5p可能通过介导MKP-1的表达参与抑郁症神经免疫的发病过程,故let-7a及MKP-1可能是抑郁症神经炎症发生的关键因子。