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我国动物血液资源丰富,如不加以合理开发利用,直接排放到环境中,不仅浪费了宝贵的蛋白质资源,而且对环境造成严重的污染。血红蛋白作为血液中的最主要蛋白质,由于其色泽猩红、腥味重、不易保藏以及被人体消化吸收,而难以开发利用。利用现代高新技术开发高附加值产品,进一步提高动物血液的利用率,对动物血液制品的工业化和生态环境的保护具有重要的意义。本研究以牛血血红蛋白为研究对象,研究中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、木瓜复合蛋白酶、Protamex蛋白酶、Flavourzyme蛋白酶单酶体系对血红蛋白的酶水解作用,并采用内切酶和外切酶分步酶解方法,确定水解血红蛋白的最佳条件,通过测定水解度、蛋白质回收率、氨基氮含量、TCA可溶性氮含量、血红素含量等指标,确定最佳的酶解工艺条件,为血红蛋白制品的开发和工业化生产提供理论依据。并利用体外抗氧化活性测定方法对酶解产物的抗氧化活性进行检测,探索利用动物血液血红蛋白提取抗氧化肽的可行性,为动物血液制品的开发利用探索新的道路。实验结果表明,对牛血血红蛋白进行酶法水解,以水解度(DH)和TCA可溶性氮含量为指标,中性蛋白酶水解效果最好;以蛋白回收率、血红素含量作为衡量指标,木瓜复合蛋白酶效果最好。通过单因素水平试验和正交实验,确定了中性蛋白酶的最佳水解条件、中性蛋白酶和风味蛋白酶的双酶复合酶解最佳工艺和木瓜复合蛋白酶分段升温酶解最佳工艺。实验证明采用双酶复合酶解血红蛋白效果明显好于单酶酶解,水解液的水解度、蛋白质回收率、氨基氮含量、TCA可溶性氮含量都有所增加,水解度可达到52.9%,比单酶水解提高了55%,水解液中TCA可溶性氮含量为70.6%。
通过SDS-PAGE电泳研究血红蛋白酶解产物的分子量分布,探讨酶的种类,水解方式对酶解产物分子量分布的影响。结果显示,双酶分步酶解所得水解液中多肽平均分子量明显小于单酶水解液,单酶水解液中多肽分子量集中在3000~8000Da,双酶复合水解液中大部分多肽分子量低于6000Da,部分多肽分子量在3000Da以下。
本研究采用荧光光度法检测了酶解产物抗氧化活性,发现牛血血红蛋白水解液具有较强清除羟自由基的能力,最高清除率可达到76%。而且酶解产物清除羟自由基能力受到蛋白酶种类、水解方式、水解时间、水解度、水解液蛋白浓度的影响。并通过对荧光光度法的反应体系进行研究,证明该方法相比紫外分光光度法灵敏度高,数据重现性好,操作方法简便,并且不受水解液中血红素和Fe2+、Fe3+的干扰,可以广泛应用于水溶性有色抗氧化物质清除羟自由基能力的检测。