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间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)具有强大的自我更新能力和多向分化潜能,在再生医学领域具有广阔的发展前景。目前,骨髓MSCs、脂肪MSCs和脐带MSCs的功能及作用机制得到了较为广泛的研究,并且已逐步应用到了临床。同成人MSCs相比,胎儿的MSCs具有以下特点:不仅增殖能力更高、多向分化潜能更强,而且免疫原性更低。这些优势使得胎儿MSCs引起广泛的关注。胎儿真皮MSCs(Fetal dermal MSCs,FDMSCs)提取自孕中期胎儿真皮组织,是介导胎儿皮肤无瘢痕愈合最主要的细胞,在皮肤组织的修复再生领域具有潜在的优势。近年来,MSCs的旁分泌作用引起了学者们的广泛关注和深入研究,许多研究成果和临床数据表明MSCs主要通过旁分泌机制发挥作用。通过旁分泌作用,MSCs向细胞外释放生长因子、细胞因子、炎性介质、外泌体等一系列生物活性物质。其中,外泌体介导的信号传递是MSCs发挥作用的主要机制之一。外泌体是直径30-150nm的圆形小囊泡,携带多种生物活性物质,一般包括蛋白质、核酸、脂质,由脂质双分子层包裹,被细胞分泌至细胞外基质中,通过向靶细胞传递这些物质介导细胞间的通讯。外泌体通过改变靶细胞的蛋白质和基因表达,调控细胞增殖、细胞侵袭、血管生成、免疫反应等过程,参与机体的各种生理病理过程。外泌体还可作为疾病的特异性生物标志物,用于多种疾病的诊断、作为运输载体靶向传递药物。在组织修复过程中,MSCs来源的外泌体发挥着同MSCs相似的作用:促进修复、促进内源性再生、促进血管生成、调节免疫反应等。然而MSCs的外泌体促进皮肤创面愈合的具体分子机制还不清楚,亟待进一步探究。我们推测,外泌体作为FDMSCs发挥其修复作用的重要媒介,能够促进皮肤创面愈合。为了验证这一假说,我们提取了 FDMSCs的外泌体(FDMSC-derived exosome,FDMSC-Ex)并将其应用于小鼠皮肤损伤模型,发现FDMSC-Ex能够显著加快小鼠创面的愈合速度;为了进一步探究FDMSC-Ex促进创面愈合的分子机制,我们将FDMSC-Ex应用于成人真皮成纤维细胞(Adult dermal fibroblasts,ADFs),检测ADFs的增殖、迁移、合成细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的能力及相应信号通路的改变。FDMSC-Ex孵育后,ADFs的增殖、迁移和ECM蛋白合成能力增强,同时发现Notch通路被激活;应用抑制剂DAPT阻断Notch通路后,ADFs的增殖和迁移能力显著下降。为了进一步探索Notch通路激活的原因,我们检测了 FDMSC-Ex中Notch通路5种配体蛋白(Jagged 1、Jagged 2、Dll-1、Dll-3、D11-4)的表达情况,发现FDMSC-Ex中只表达Jagged 1而不表达其他四种配体蛋白。为了验证Jagged 1在FDMSC-Ex介导的促进愈合功能中的作用,使用Jagged 1多肽模拟Jagged 1对Notch通路的激活作用,使用siRNA敲除Jagged 1在FDMSC-Ex中的表达,结果证实,Jagged 1是FDMSC-Ex激活ADFs Notch通路的关键因子,介导FDMSC-Ex发挥促进愈合的作用,由此阐明FDMSC-Ex促进皮肤组织创面愈合的分子机制。本研究探索了 FDMSC-Ex促进创面愈合的分子机制,分析MSCs外泌体的临床应用前景,为今后FDMSC-Ex用于临床难愈性创面、大面积烧伤、皮肤缺损等创面的治疗提供了理论基础。研究目的提取FDMSC-Ex,研究FDMSC-Ex对皮肤创面愈合和ADFs功能的影响,阐明FDMSC-Ex促进皮肤创面愈合作用的分子机制。研究方法1.提取FDMSC-Ex。从人胎儿皮肤组织提取FDMSCs并进行多向分化潜能、细胞表面标记物的检测;从FDMSCs的条件培养基中提取FDMSC-Ex,通过透射电镜观察形态并测量直径、通过Western blot检测其标记物(Tsgl01、Alix和CD63)、并进行了外泌体粒径分析。2.动物实验。构建小鼠背部10mm×10mm皮肤全层创面模型,术后即刻在创面周围分4个点共注射200μl 1mg/ml的FDMSC-Ex。分别于术后第7、14天观察皮肤创面愈合情况,拍照,并取创周皮肤标本进行组织学检测。3.FDMSC-Ex摄取实验。使用PKH26标记FDMSC-Ex,然后将标记好的FDMSC-Ex加入ADFs中孵育24小时,DAPI染核后使用荧光显微镜观察。4.ADFs 增殖实验。将 FDMSC-Ex 按照 1 μg/ml、10μg/ml、1OOμg/ml 的浓度梯度加入ADFs中进行孵育,24小时后使用CCK-8的方法检测细胞的增殖能力。5.ADFs迁移实验。使用划痕实验和transwell实验方法,向ADFs中加入1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml的FDMSC-Ex干预细胞。孵育24小时后,显微镜下测量单层细胞机械划痕两侧的宽度(划痕实验);transwell实验则在细胞固定、结晶紫染色后去除小室内层细胞后,计数穿过小室膜到达小室外侧的细胞数目,检测ADFs的迁移能力。6.ADFs合成ECM蛋白能力的检测。使用RT-PCR检测FDMSC-Ex孵育后ADFs合成ECM蛋白(Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、弹性蛋白、纤维粘连蛋白、α-平滑肌肌动蛋白)的能力。7.Notch信号通路的检测。使用Western blot检测Notch通路中活性Notchl、Jagged 1和下游蛋白Hes 1的表达量改变;为了进一步验证Notch通路的作用,使用抑制剂DAPT阻断Notch通路后,再次检测ADFs的增殖和迁移。检测FDMSC-Ex中Notch通路配体蛋白表达情况,分析引起Notch通路活性改变的原因。8.Jagged 1作用的检测。使用Jagged 1多肽模拟Jagged 1对Notch通路的激活作用,使用siRNA敲除Jagged 1在FDMSC-Ex中的表达,检测Jagged 1在Notch通路激活和FDMSC-Ex促进创面愈合中的作用。研究结果1.成功提取并鉴定FDMSC-Ex。2.FDMSC-Ex促进小鼠背部皮肤创面愈合。3.FDMSC-Ex 能被 ADFs 摄取。4.FDMSC-Ex增强ADFs的增殖、迁移、合成ECM的能力。5.FDMSC-Ex通过激活Notch信号通路提高ADFs促进创面愈合的能力。阻断Notch通路后,ADFs的增殖与迁移能力显著降低。6.FDMSC-Ex中的Jagged 1蛋白激活Notch通路促进创面愈合。结论1.FDMSC-Ex促进小鼠背部皮肤创面愈合。2.FDMSC-Ex增强ADFs的增殖、迁移、合成ECM的能力。3.FDMSC-Ex通过激活Notch信号通路提高ADFs创面愈合的能力。阻断Notch通路后,FDMSC-Ex促进ADFs增殖与迁移的能力显著降低。4.FDMSC-Ex中的Jagged 1蛋白能够激活Notch通路,提高ADFs的增殖、迁移能力,在促进创面愈合中起到重要作用。