苎麻雄性不育相关候选基因atp9和atpA的功能验证研究

来源 :云南大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jincaijuan
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核质互作雄性不育(cytoplasmic male sterility)是植物普遍存在的一种现象,已作为防止自交的有效手段被广泛地用于作物的杂交优势利用中,研究其分子机制有利于更有效地利用雄性不育。苎麻(Boehmeria nivea)核质互作雄性不育特性被发现以来,对其机理的研究主要集中在生理生化方面和不育相关基因的分子克隆方面,而对于其不育基因功能的探索国内外还未见报道。为此,本文从苎麻保持系叶片中克隆出了雄性不育性相关基因atp9和atpA基因ORF框片段的eDNA序列与拟南芥alternative oxidase1A基因前导肽核苷酸序列,分别共同构建了表达载体,进行了苎麻GS13-X1品系再生体系的探索,通过农杆菌介导转化苎麻和拟南芥,获得了拟南芥抗性植株,并对抗性植株进行了分子鉴定和形态学观察。为雄性不育性基因功能的研究积累资料。主要研究结果如下:  1.从苎麻中获得了atp9和atpA基因ORF框片段的eDNA序列,并和其它植物的同源序列进行了比对,分析了atp9和atpA基因在这些物种中的同源关系和系统发育位置。  2.从拟南芥中克隆得到AOX前导肽DNA序列,并将其连入到载体pBI121上,获得AOX-pBI中间载体。将获得的atp9和atpA基因片段亚克隆到T载体上,获得Y-atp9和T-atpA载体。使用限制性内切酶酶切获得atp9和atpA基因目的片段,将其分别连接到载体AOX-pBI上,获得表达载体AOX-atp9-pBI和AOX-atpA-pBI。  3.获得了苎麻GS13-X1品系的最佳诱导愈伤培养基配方为MS+2mg/L6-BA+0.5mg/L2,4-D;最佳诱导分化培养基配方为MS+2mg/L6-BA+0.3mg/L2A-D;最佳生根培养基配方为MS+0.1mg/LNAA。并且还得出了最佳诱导愈伤的Kan筛选浓度为30mg/L,最佳诱导生根的Kan筛选浓度为80mg/L。  4.通过农杆菌介导获得了拟南芥抗性植株,PCR和Southern杂交检测表明得到表达载体AOX-atp9-pBI和AOX-atpA-pBI转基因植株;Northern杂交检测到转入的atp9和atpA基因片段序列的表达信号。对转基因植株的生长状况、花器官的形态和花粉活力进行观察,得出部分转基因拟南芥表现出雄性育性降低的现象。
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