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第一节 梅毒螺旋体外膜蛋白TprK生物信息预测[目的]通过生物信息学途径预测梅毒螺旋体TprK蛋白的基本生物信息。[方法]利用ProtParam在线工具预测分子量、等电点、吸光度、半胱氨酸含量等生物化学信息;利用PSORT预测TprK蛋白定位以及PRED-TMBB预测β桶外膜蛋白跨膜区;利用Signal5.0在线服务器预测TprK蛋白信号肽;通过BLAST程序分析TprK蛋白同源性;Phyre2在线工具对蛋白质的二级结构和结构域的组成进行预测;通过SWISS-MODEL、I-TASSER、AlphaFold在线平台预测TprK蛋白三级结构。[结果]ProtParam在线工具预测结果显示,TprK包含503氨基酸残基,其分子量为 55391.99 道尔顿（Dalton,Da）,理论等电点（Proteinisoelectricpoint,PI）为9.11,吸光系数为2.089,稳定系数为24.17。PSORT在线工具分析TprK亚细胞定位,外膜的定位分数为9.49,远远高于其他定位的分数（胞质:0.03;胞质膜:0.01;周质:0.09;胞外:0.38）。PRED-TMBB结果表明,TprK蛋白大部分序列构成跨膜区,-NH2端和-COOH端均在胞质一侧,胞外部分包含一些长度不等的肽链。此外,利用SianalP 5.0在线软件进行信号肽分析,结果表明TprK蛋白-NH2端存在信号肽序列。Phyre预测结果显示TprK蛋白二级结构包含大量的β折叠,较少的α螺旋。SWISS-MODEL、I-TASSER两个三维结构在线预测平台未提供可信度较高的TprK蛋白三维结构信息。AlphaFold预测结果显示TprK整体结构为20个反向平行的β片构成的β桶结构;蛋白的-NH2端和-COOH端均位于周质一侧,-NH2端的1-60位氨基酸为不规则Loop区域;TprK胞外一侧含有丰富的Loop区域。[结论]TprK蛋白为55391.99 Da的梅毒螺旋体外膜蛋白,其预测的三维蛋白结构为20个反向平行的β片构成的β桶,胞外一侧含有丰富的Loop区域。第二节梅毒螺旋体外膜蛋白TprK表达纯化及结构初探[目的]利用原核表达系统制备大量高纯度的全长TprK重组蛋白,筛选出合适的类脂质环境维持TprK蛋白稳定结构,为TprK高分辨率结构解析提供基础。[方法]运用重组基因技术,构建pET28a-6 × His-tprK和pET28a-3 × FLAG-tprK原核表达载体。将表达载体转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中过表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、蛋白免疫印迹（Western-blot）和质谱分析（LC-MS/MS）鉴定目的蛋白表达情况。收集细胞膜,匀浆后的细胞膜溶液中加入去污剂溶膜,然后进行亲和层析和凝胶过滤层析纯化目的蛋白。为了获得性质稳定TprK蛋白样品,将亲和层析洗脱蛋白样浓缩后,滴入包含新去污剂的缓冲液（DDM,DM,OG,LADO,CYMAL7,LMNG）,重新浓缩后进行凝胶过滤层析,根据凝胶过滤层析峰形推测蛋白状态。随后利用负染电子显微镜评估蛋白性质。取LMNG-TprK凝胶过滤层析峰尖样品浓缩至10mg/ml后,进行结晶筛选。此外利用Nanodiscs重构TprK蛋白,负染电子显微镜观察重构样品凝胶过滤层析峰尖样品,然后选取均一性和分散性较好的Nanodiscs重构的TprK蛋白样品进行冷冻样品的制备与观察。[结果]经测序证明,同源重组载体与理论序列一致。SDS-PAGE、Western blot显示超速离心沉淀（包含大肠杆菌膜）样品在约55 kDa处有显著条带,与TprK蛋白理论分子大小一致。质谱分析显示SDS-PAGE胶条包含大量梅毒螺旋体Nichols株TprK蛋白的肽段。利用膜蛋白纯化常用的去污剂Fos-choline-12、LDAO、LMNG、DDM、DM、CYMAL7、OG 溶膜,Fos-choline-12 能将 TprK 蛋白从细菌脂质双分子层中置换出来,其他去污剂（LDAO,LMNG,DDM,DM,CYMAL7,OG）增溶效果较差。利用Ni-NTA亲和层析无法得到纯度较高的TprK蛋白,更改Flag标签后,蛋白纯度大大提高。但是Fos-choline-12凝胶过滤层析峰形欠佳。去污剂置换为LMNG的凝胶过滤层析峰形较好,提示绝大多数处于寡聚的状态。负染电子显微镜观察LMNG包裹的TprK蛋白质颗粒均匀,绝大多数为分散单个颗粒。蛋白结晶筛选仅得到两个结晶条件,X线衍射法判断晶体为盐晶。凝胶过滤层析纯化TprK蛋白-Nanodiscs重构样品结果显示在约16.5 ml的洗脱体积处存在一个窄峰,对凝胶过滤层析峰尖样品进行负染电镜观察,可见蛋白质样品颗粒均匀,无聚集。透射电镜下观察到Nanodiscs重构的TprK蛋白样品均一性和颗粒的衬度较差,无法将样品回收进行冷冻电镜数据收集。负染电子显微镜观察LMNG包裹的TprK蛋白样品和Nanodisc重构TprK蛋白样品,可见深灰色的背景内散在分布着浅色圆斑,圆斑中心部分分布一个黑色的圆点。[结论]本研究利用大肠杆菌表达系统在细菌膜上成功表达梅毒螺旋体外膜TprK蛋白。结果显示大部分目的蛋白于大肠杆菌细胞膜组分中过表达,过表达的TprK能正确上膜,提示三维结构趋近于梅毒螺旋体TprK的天然构象。通过去污剂筛选的方法获得了 TprK溶膜效率最高的去污剂Fos-choline-12。进一步利用去污剂将过表达的TprK蛋白从大肠杆菌细胞膜中提取出来,并通过亲和纯化、凝胶过滤层析得到足量、高纯度全长TprK重组蛋白。为了获得更均一的蛋白样品用于TprK高分辨率结构的解析,在溶液中通过去污剂置换的方法,结合负染电子显微镜对蛋白样品进行评估和初步结构分析摸索,构建了两个膜外脂质双分子层模拟系统（去污剂LMNG和Nanodiscs）,这两个系统可以很好的维持TprK在溶液中的蛋白构象和稳定状态。除此之外,还进行了晶体筛选和蛋白冷冻样品制备,初步摸索尝试通过X射线晶体学衍射技术和冷冻电镜单颗粒技术解析TprK蛋白高分辨率结构。通过负染电子显微镜观察到TprK蛋白中心存在孔状结构,符合外膜蛋白β桶的结构特征,表明体外纯化的TprK蛋白保持了其天然构象,推测TprK蛋白具有外膜孔蛋白的结构和功能。