论文部分内容阅读
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus, VP)广泛分布于沿岸海水、海底沉积物及虾类,蟹类和贝类等海产品中,属革兰阴性短杆菌,有致病菌株和非致病菌株之分。致病菌株可引起人类腹泻、恶心、呕吐、腹部痉挛,严重的可以引起昏迷、脱水甚至死亡。因此,建立灵敏快速的检测方法,了解副溶血弧菌在市售水产品的分布情况,对于食品卫生检测意义重大。为研究副溶血弧菌流行情况及毒力基因的分布情况,从上海部分农贸市场及海产品批发市场采集样品183份,共鉴定出弧菌疑似株195株。基于看家基因gyrB测序,将195株菌株确定到种的水平,包括副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)菌株137株(占70.3%)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)24株(占12.4%)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)13株(占6.7%)和纳瓦拉弧菌(Vibrio navarrensis)3株(占1.6%)。选取副溶血弧菌的4种主要毒力因子：耐热直接溶血素(tdh)、耐热相关溶血素(trh)和Ⅲ型分析系统结构蛋白基因(vcrDl和vcrD2),进行PCR检测。结果显示,vcrD1检出率为100%,其它3种基因分别为tdh (1.5%), trh (0%), vcrD2(0.74%)采用ERIC-PCR方法对2011～2013年分离的副溶血弧菌菌株及标准株基因组DNA进行分型,结果显示副溶血弧菌采用此种分型方法能得到多态性较好的指纹图谱,能扩增出2至14个大小在100bp到4000bp之间的条带,将137株分为6群和16类,不同月份及来源样品有聚类趋势。分型结果与菌株的致病力有一定的相关性。ERIC-PCR分型快速简单,且较其他分子分型技术具备不要求模板序列已知而直接进行扩增的优点,适用于大量副溶血弧菌的快速分型研究,能够为副溶血弧菌食物中毒事件的预防和流行病学调查提供参考依据。对副溶血弧菌耐热直接溶血素基因(tdh)进行克隆、原核表达与免疫活性分析。结果表明,重组TDH蛋白主要以包涵体形式在大肠杆菌中表达,分子量大小约27kDa；Western blotting分析表明,经过复性后的蛋白具有与天然蛋白相同的免疫反应性；重组蛋白免疫家兔,ELISA检测多抗血清效价在1：256000以上,为进一步研究TDH蛋白功能及副溶血弧菌快速检测方法奠定了基础。