论文部分内容阅读
目的:通过研究通管丸含药血清对RAW264.7细胞炎症模型中磷酸化IRAK4、IKKs蛋白表达水平的影响,从蛋白质分子水平对通管丸治疗输卵管炎性阻塞性不孕的作用机制进行阐明,为中医药防治输卵管炎性阻塞性不孕提供切实可靠的实验依据。方法:1.将10只未孕雌性SPF级Wistar大鼠随机分为实验组和对照组。实验组的大鼠予以通管丸混悬液灌胃,对照组予以等量生理盐水灌胃,连续灌胃3天后,经腹主动脉采血,制备血清。2.将RAW264.7细胞分为9个组:正常培养组、无药血清组(5%,10%,20%,40%)、含药血清组(5%,10%,20%,40%)。正常培养组的添加10%胎牛血清,无药血清各组分别添加含有5%、10%、20%、40%无含药血清,含药血清各组分别含有添加5%、10%、20%、40%含药血清,经培养后采用CCK8法检测RAW264.7细胞最佳生存的含药血清浓度。3.将RAW264.7细胞分为造模组和非造模组,造模组的培养基中添加100ng/ml脂多糖,非造模组培养基中添加等量的PBS溶液,培养24h后,采用ELISA法检测两组中TNF-α、IL-1β炎症因子的含量,以确定100ng/ml的脂多糖能否成功制造巨噬细胞炎症模型。4.最后将RAW264.7细胞分成空白对照组、PPAR-γ激动剂组、NF-κB阻断剂组、无含药血清组和含药血清组。空白对照组培养液中添加正常RAW264.7细胞和10%胎牛血清;NF-KB阻断剂组添加造模后的RAW264.7细胞和20umol/L NF-κB阻断剂SN50;PPAR-γ激动剂组添加造模后的RAW264.7细胞和20umol/L吡格列酮;无含药血清组添加造模后的RAW264.7细胞和10%无含药血清;含药血清组添加造模后的RAW264.7细胞和10%含药血清。培养24小时后收取细胞上清液,采用Western Blot法测定各组中磷酸化IRAK4、IKKs蛋白的表达。结果:1.各组RAW264.7细胞活力的比较与正常培养组相比较,5%无药血清组和20%无药血清组RAW 264.7细胞活力无明显变化,差异无明显统计学意义(P>0.05);10%无药血清组、5%含药血清组、10%含药血清组、20%含药血清组RAW264.7细胞活力明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05);40%无药血清组、40%含药血清组RAW 264.7细胞活力明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。与10%含药血清组相比较,5%含药血清组、20%含药血清组和40%无药血清组RAW 264.7细胞活力明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.各组RAW 264.7细胞TNF-α、IL-1β蛋白含量比较与非造模组相比较,造模组TNF-α、IL-1β含量明显增加,差异具有统计学意义(P<0.01)。3.各组RAW 264.7细胞磷酸化IRAK4、磷酸化IKKs蛋白相对表达量比较与空白对照组相比较,无含药血清组、无含药血清组、NF-κB阻断剂组、PPAR-γ激动剂组、含药血清组RAW 264.7细胞中磷酸化IRAK4、IKKs蛋白表达增加,差异具有统计学意义(P<0.05);与无含药血清组比较,NF-κB阻断剂组、PPAR-γ激动剂组、含药血清组RAW 264.7细胞中磷酸化IRAK4、IKKs蛋白表达均降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.RAW264.7细胞生存最佳的血清浓度为10%。2.100ng/ml LPS能成功制造巨噬细胞炎症模型。3.通管丸治疗输卵管炎性阻塞性不孕的作用机制可能为通管丸通过抑制TLR2/My D88/NF-κB信号通路中“关键元件”磷酸化IRAK4、IKKs蛋白的表达,从而抑制TLR2/My D88/NF-κB信号通路的活化,减少炎症因子及其炎症介质的表达,达到抑制输卵管炎症反应的目的。