钛基表面TiO2纳米棒阵列的制备及不同纳米构相TiO2对成骨细胞黏附形态的研究

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将骨植入材料植入生物体后,细胞在材料表面的黏附是骨组织形成最为关键的早期阶段,对后续的细胞增殖、分化以及功能表达产生着重要的影响,同时还决定着骨植入材料能否种植成功。影响细胞在材料表面黏附行为的因素有很多,主要包括材料表面的化学成分、表面形貌、表面粗糙度及表面亲水性等,所以通过对生物材料表面改性可以影响细胞在其表面的黏附行为。纳米材料具有与普通材料截然不同的性质,这些年已被广泛应用在生物材料表面改性领域,而且已有文献报道在同种材料的光滑表面和纳米结构表面,细胞的黏附行为表现出明显的差异。目前TiO2纳米构相对细胞黏附行为影响的研究主要集中在TiO2纳米管阵列、TiO2纳米颗粒薄膜、TiO2纳米网格等,但关于TiO2纳米棒阵列对细胞黏附行为影响的研究还未见报道。现在用于量化细胞在生物材料表面黏附行为的方法主要包括扫描电子显微镜(SEM)、荧光显微镜、MTT活性测试、乳酸脱氢酶(LDH)活性测试等,但这些方法均是在高真空或是离线状态下进行的,无法对细胞黏附的整个过程进行在线实时分析,所以发展一种可以对细胞黏附进行原位实时分析的方法是非常有必要的。在以上所述研究背景下,本论文利用水热合成法在钛基表面制备了四种不同形貌的TiO2纳米棒阵列结构,并研究了这四种结构对细胞黏附、铺展行为及细胞活性的影响;另外我们还利用石英晶体微天平结合纳米颗粒自组装技术对细胞在TiO2纳米颗粒薄膜表面的黏附行为进行了实时的动态分析。具体工作如下:(1)用水热合成法在钛基表面制备了TiO2纳米棒阵列结构,并研究了反应时间、反应温度以及NaCl浓度对纳米棒形貌的影响,结果发现NaCl浓度越高,TiO2纳米棒阵列的取向性越好,形貌越均一;反应时间越长,TiO2纳米棒阵列棒长越大,但直径没有明显变化;反应温度越高,TiO2纳米棒阵列的直径和棒长也越大,100℃时形成的是直径约为20nm的较细TiO2纳米棒阵列,160℃时形成的是直径约为100nm的较粗的TiO2纳米棒阵列;充分研究了各种实验条件的影响后在最优实验条件下合成了四种有用的TiO2纳米棒阵列结构,分别记为TNR1, TNR2, TNR3和TNR4。利用接触角测量仪检测了水滴在四种材料表面的接触角,发现TNR1和TNR2是亲水性材料,亲水性比纯钛好,而TNR3和TNR4是疏水性材料,亲水性没有纯钛好。(2)利用SEM、荧光显微镜和LDH技术研究了四种TiO2纳米棒阵列(即TNR1, TNR2,TNR3和TNR4)对成骨细胞黏附的影响,发现在任何相同的培养时间,TiO2纳米棒阵列表面的细胞数目总比纯钛基表面细胞数目多,细胞在TiO2纳米棒阵列表面黏附和铺展的速度比在钛基表面黏附和铺展的速度快,另外,细胞在TiO2纳米棒阵列表面具有比钛基表面更高的细胞活性。在这四种材料中,TNR2和TNR1最有利于细胞的黏附和生长,TNR2表面细胞的活性最高。(3)通过layer-by-layer纳米自组装技术在石英晶体谐振器表面自组装了1、2、3、4层TiO2纳米颗粒薄膜层,结合QCM技术研究了组装薄膜过程中石英晶体谐振器频率与组装层数之间的关系,并用AFM、SEM.台阶仪和接触角测量仪对TiO2纳米颗粒薄膜层的形貌、厚度和亲水性等做了表征,发现层数越多,TiO2纳米颗粒薄膜层厚度和粗糙度越大,亲水性越好;将石英晶体谐振器和成骨细胞在无菌环境下共同培养后,利用SEM、MTT、LDH和荧光显微镜等静态表征技术对细胞进行了研究,发现在任何相同培养时间,层数越多的薄膜表面细胞数越多且细胞黏附和铺展得越好;刚开始培养的一段时间内,TiO2纳米颗粒薄膜层表面的细胞比钛薄膜表面的细胞具有更高的细胞活性,由于薄膜表面TiO2纳米颗粒的脱落会导致细胞损伤或死亡,当培养时间延长后发现4层TiO2纳米颗粒薄膜层表面的细胞活性比钛薄膜表面低;结合QCM技术对较短培养时间内细胞黏附的动力学过程进行监测,发现基底材料与细胞培养液接触的开始阶段发生的是蛋白质的黏附,当蛋白质黏附达到平衡后细胞才开始在基底材料表面发生黏附。
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