背景急性肺损伤（acute lung injury,ALI）/急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）是一种严重的肺部炎症性疾病,有着发病率高,治愈率低的特点。炎症失控导致的炎症风暴是ALI/ARDS发生发展的中心环节,炎症细胞中的巨噬细胞在其中发挥着重要的作用。肺部巨噬细胞是肺免疫系统中最关键的免疫细胞之一。与经典的炎症反应有所不同,浸润肺部的巨噬细胞通常呈现出激活的极化状态,这对于调节肺部组织的生理功能有重要作用。肺部巨噬细胞主要包括两种类型:肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages,AMs）与肺间质巨噬细胞,其中肺泡巨噬细胞的极化一般可分为两种表型:经典活化型巨噬细胞（M1）和交替活化型巨噬细胞（M2）。在ALI的急性渗出期,肺泡巨噬细胞呈M1极化表型,释放大量促炎介质和趋化因子,招募中性粒细胞和单核细胞。在ALI的炎症消退期,肺泡巨噬细胞转化为M2表型,通过加速炎症消退来促进组织修复。在疾病条件下,过多的促炎介质的释放会导致不可控的炎症风暴和严重的组织损伤。因此,将肺泡巨噬细胞表型从M1调整到M2有望对治疗ALI提供新策略。迄今为止,对于ALI/ARDS基于药物的临床治疗在降低患者短期或长期死亡率方面无太大进展,这就促使开发新的干预策略和技术。近年来,纳米材料已被证明可以用来增强药物的给药和治疗效果。纳米材料可用于提高药物递送效率、增强药物靶向特性、减少药物副作用等方面。纳米医学的进步也为ALI的治疗提供了新的解决方案。DNA纳米技术作为一种新兴的给药系统,由于其具有良好生物兼容性、无毒性、无免疫原性等特点而受到广泛关注。作为一类天然可生物降解的纳米材料,DNA纳米结构是安全的药物输送载体,不会引起全身毒性问题。更重要的是,DNA纳米结构在纳米级的可编程性、允许修饰多种功能,例如靶向部分和响应单元。目前DNA纳米组装策略有两种:一种是利用金属阳离子如镁离子等来介导DNA纳米结构自组装;另一种是利用内源性多胺、碱性氨基酸等非传统方式来组装DNA纳米结构。亚精胺（spermidine,Spd）是一种天然多胺,具有三个正电荷,可以与核酸和蛋白质相互作用。亚精胺具有抗炎、抗氧化、抗衰老等多重作用,而亚精胺的这些功能与自噬密切相关。研究表明,巨噬细胞自噬能抑制脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的炎症反应。此外,巨噬细胞自噬的增强有助于M2巨噬细胞分化。自噬可以被多种信号通路调节,包括经典的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白-（mammalian target of rapamycin,mTOR）通路,同时抑制mTOR可提高自噬。基于以上背景,我们提出了一种亚精胺和小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）纳米平台来治疗ALI。我们认为亚精胺可以中和DNA带的电荷并介导DNA四面体（tetrahedron,TET）的组装。亚精胺不仅可以作为DNA四面体纳米结构合成的介质,还可以作为一种药物。载有mTOR siRNA的亚精胺/DNA四面体(TETSpd-mTOR)具有两个功能单元:亚精胺和mTOR siRNA。TETSpd-mTOR中的亚精胺通过腺苷5’-单磷酸激活蛋白激酶（adenosine 5‘-monophosphate-activated protein kinase,AMPK）-mTOR通路增强巨噬细胞自噬,而mTOR siRNA同样增强巨噬细胞自噬。在本研究中,拟使用亚精胺介导的DNA四面体的组装,与mTOR siRNA结合,构建一种负载mTOR siRNA的亚精胺/DNA四面体纳米药物递送系统,并在ALI体外和体内模型中评估其协同抑炎效应。研究方法:1.携带mTOR siRNA的亚精胺/DNA四面体(TETSpd-mTOR)的设计依照碱基互补配对原则,使用SEQUIN软件设计了四条D N A单链,四条D N A单链能合四面体。根据合成、验证后的siRNA,设计一条与siRNA的反义链互补的DNA链,并将其连在四条DNA单链上,从而构建携带mTOR siRNA的亚精胺/DNA四面体。2.TETSpd-mTOR的合成、表征与生物兼容性（1）TETSpd-mTOR通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）、原子力显微镜（atomic force microscopy,AFM）、激光动态散射法（dynamic light scattering,DLS）进行合成、表征验证。（2）通过PAGE对TETSpd-mTOR的血清稳定性、pH稳定性等进行评估。（3）MTS法检测亚精胺对骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages,BMDMs）的毒性及TETSpd-mTOR negative control(TETSpd-mTOR NC)对BMDMs的毒性。（4）激光共聚焦（confocal laser scanning microscopy,CLSM）、流式细胞术（fluorescence-activated cell sorting,FASC）检测BMDMs对TETSpd-mTOR NC的摄取效率。3.TETSpd-mTOR在体外协同抗炎效应研究（1）定量PCR（reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）,蛋白质印迹法（Western Blot,WB）检测TETSpd-mTOR对BMDMs自噬影响情况。（2）RT-qPCR,FASC检测TETSpd-mTOR对BMDMs极性影响情况。（3）RT-qPCR,流式多因子检测TETSpd-mTOR对BMDMs炎症因子分泌影响情况。4.携带mTOR siRNA的亚精胺/DNA四面体在体内协同抗炎效应研究（1）小动物成像检测TETSpd-mTOR NC在ALI小鼠体内分布情况。（2）病理切片观察肺部炎症情况;免疫组化检测肺部mTOR敲低情况;BCA（bicinchonininc acid）法检测肺泡灌洗液（broncho alveolar lavage fluid,BALF）中蛋白情况。（3）FASC检测TETSpd-mTOR对肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages,AMs）的极性影响情况。（4）流式多因子检测TETSpd-mTOR对肺泡灌洗液中炎症因子分泌影响情况。研究结果:1.DNA四面体的设计与构建通过SEQUIN软件设计了DNA四面体,通过PAGE表征DNA四面体能成功合成且产率较高;通过DLS、AFM验证了DNA四面体的粒径大小符合理论值。2.亚精胺介导TETSpd-mTOR的自组装（1）实验表明亚精胺在浓度为50μM时介导DNA四面体合成产率最大。DLS对亚精胺介导携带mTOR siRNA的DNA四面体进行测量,其尺寸在11.8±1.4 nm,与理论值相符。（2）TETSpd-mTOR具有较好的血清稳定性、pH稳定性、低离子浓度稳定性。3.TETSpd-mTOR的生物兼容性研究（1）通过MTS法检测亚精胺和TETSpd-mTOR NC对BMDMs的毒性作用。实验结果表明亚精胺浓度在40μM及以下时,亚精胺对BMDMs无毒性作用;TETSpd-mTOR NC在siRNA浓度为0～900 n M时对BMDMs无毒性作用。（2）TETSpd-mTOR合成后经过H2O、TAE、Spd洗后仍保持完整的结构。（3）激光共聚焦以及流式细胞术结果发现TETSpd-mTOR被BMDMs摄取比TETMg-mTOR高,为1.5倍。（4）TETSpd-mTOR进入细胞后主要定位在溶酶体内,其共定位（Colocalization Pearson’s）系数为0.76。4.TETSpd-mTOR在体外具有协同抑炎作用（1）RT-qPCR,WB,CLSM验证TETSpd-mTOR协同下调mTOR表达,增强BMDMs自噬。（2）RT-qPCR验证TETSpd-mTOR上调BMDMs M2型maker:Arg1、CD163与CD206,下调M1型maker:i NOS、CD80与CD86。流式细胞术同样验证TETSpd-mTOR上调BMDMs M2型maker:F4/80+CD86+,下调M1型maker:F4/80+CD206+。（3）RT-qPCR验证TETSpd-mTOR抑制炎症因子TNF-α,IL-1β,IL-6的表达;多因子检测同样验证TETSpd-mTOR抑制炎症因子TNF-α,IL-1β,IL-6的表达。5.TETSpd-mTOR在体内具有协同抑炎作用（1）小动物成像结果表明尾静脉注入TETSpd-mTOR NC后,TETSpd-mTOR NC主要富集在肝脏与肾脏,在肺部的富集相对较少。在正常小鼠与ALI小鼠中,TETSpd-mTOR NC在ALI小鼠中富集更多。（2）病理切片表明TETSpd-mTOR能缓解ALI小鼠肺组织炎症。BCA检测结果表明TETSpd-mTOR能减少BALF中蛋白含量。（3）TETSpd-mTOR能上调M2型AMs:CD45+Siglec-F+CD11c+CD206+的比例,下调M1型AMs:CD45+Siglec-F+CD11c+CD86+的比例。（4）多因子检测结果验证TETSpd-mTOR抑制BALF中炎症因子TNF-α,IL-1β,IL-6的浓度,升高IL-10的浓度。结论:1.成功构建了亚精胺/DNA四面体复合纳米,该复合纳米材料有较好的稳定性及较高的细胞摄取效率。2.体外研究中,亚精胺/DNA四面体复合纳米能协同增强BMDMs自噬,促进BMDMs往M2型转化,抑制炎症。3.ALI动物模型上,亚精胺/DNA四面体复合纳米具有更高的肺部富集效率,能协同促进肺泡巨噬细胞M2型转化,抑制肺部炎症。