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背景:2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)早期阶段以胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)为主,如病程延长会导致胰岛β细胞功能逐渐减退、胰岛素分泌紊乱、糖脂代谢紊乱以及炎症的产生,并进一步发展为2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝(type 2 diabetes mellitus and nonalcoholic fatty liver disease,T2DM-NAFLD)。蒙医药是蒙古族人民在严寒酷暑中长时间与疾病搏斗累积的经验,是我国中医药必不可少的组成部分,不仅在维护人民健康中占据着重要地位,在治疗疾病中亦起着关键作用。蒙医常用药材沙蓬(Agriophyllum squarrosum(L.)Moq.)有抑制“赫依”、调节“巴达干”和治疗“希和日西精病”(糖尿病)的功效,应用历史虽久但机制不明。进一步确定沙蓬粗寡糖(Agiophyllum Oligo Saccharides,AOS)的药理作用及阐明作用机制是对其开发应用的前提。目的:1.本次实验沿用课题组前期建立的提取分离工艺,并对AOS的制备工艺进一步优化,以提升AOS提取率和纯度,为后续实验提供样品。2.AOS进行UPLC-Q-TOP/MSE分析,确定其所含糖类成分,为后续实验奠定物质基础。3.所得AOS对自发性肥胖T2DM db/db小鼠进行干预,明确AOS对糖尿病的治疗作用。4.为验证AOS对胰岛素释放和促进胰岛细胞的增殖作用,本部分以胰岛β细胞(MIN6)为研究对象,观察AOS对胰岛β细胞直接作用,进一步考察其降血糖作用机制。5.在研究过程中发现T2DM db/db小鼠异常肥胖并伴随IR的发生,这导致db/db小鼠糖脂代谢紊乱以及炎症的产生并进一步发展为T2DM-NAFLD,采用AOS进行干预,探讨AOS通过调控糖脂代谢紊乱、改善炎症进而抑制T2DM-NAFLD发生发展的分子机制。方法:1.蒙药材沙蓬中主要含有黄酮类、皂苷类、生物碱、香豆素、糖类等活性成分,此外还含有蛋白质、脂肪、碳水化合物、纤维素等。课题组前期确定沙蓬中粗提取的AOS具有降血糖作用,为了增加本次实验所得AOS的提取率及纯度,对其制备工艺进行优化,并对所获得的AOS进行UPLC-Q-TOP/MSE分析,以确定其所含糖类成分,为后续实验奠定物质基础。(1)以苯酚-硫酸分光光度法测定的低聚糖含量为评价指标,采用正交试验优化AOS的提取工艺;采用D101型大孔吸附树脂对AOS分离纯化;对已纯化AOS以低聚糖保留率、脱色率为评价指标进行活性炭脱色工艺考察。(2)通过 UPLC-Q-TOF/MSE 分析,采用 Waters Acquity BEH-C18(100 mm x 2.1 mm,1.7 μm)色谱柱,流动相为超纯水(A):乙腈(B),流速为0.3 mL·min-1,进样量为10μL,正离子模式检测AOS(以AEC为衍生化试剂),获得色谱峰和片段离子峰后,参考MassBank、Scifinder、ChemSpider等数据库和一般文献,根据分子式推断出AOS中所含糖类物质,再采用MassLynx version 4.1软件进行数据采集、分析,TargetLynx软件进行量化。2.本部分实验用T2DM db/db小鼠(雌、雄兼有,7~8周龄),根据连续2天的随机血糖(RBG)(≥16.7 mmo·L-1),即认为已形成T2DM,符合条件的小鼠随机分为Model组、二甲双胍(metformin,MET)组(160 mg·kg-1,临床等倍量)、HAOS 组(750 mg·kg-1,临床等倍量),LAOS(375 mg·kg-1,临床0.5倍量),每组12只。选用12只同源同周龄健康db/m小鼠(雌雄各半)作为Control组。各组均灌胃给予相应的受试药物,每天1次(上午8:00),连续8周,Control和Model组灌胃予同容积蒸馏水。给药期间每周测定体重、进食量、饮水量1次;分别于给药第0、2、4、6、8周测定RBG(上午10:00);于第一次给药和给药第8周测糖耐量(OGT);于第8周测定空腹血糖(FPG)、空腹血清胰岛素(FINS),计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);第8周处死前测糖化血红蛋白(HbAlc);于第8周末麻醉取血测定空腹血糖(FPG)、空腹血清胰岛素(FINS),计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);处死小鼠后取胰腺组织作病理切片,光镜观察病理改变和电镜观察超微结构;免疫组化法检测各组鼠胰腺组织中胰岛素信号通路INS-R/IRS-1/IRS-2/GLUT4蛋白的表达。3.本部分以小鼠胰岛β细胞(MIN6细胞)为研究对象,用CCK-8法观察了 AOS对胰岛细胞增殖活性的影响;AnnexinV/PI双染色法测定了 AOS对胰岛细胞凋亡的影响;应用酶联免疫吸附法测定AOS对MIN6细胞胰岛素分泌情况的影响;应用Western blot以及RT-PCR等方法测定AO S对MIN6细胞中与胰岛素信号通路相关因子INS-R、IRS和GLUT4蛋白/表达及含量,并通过免疫荧光法测定AOS对MIN6细胞中PTP1B的蛋白表达的影响。4.本部分所选实验对象为雄性自发性肥胖T2DM db/db小鼠,实验动物分组及给药方式与上述一致;连续灌胃给药8周,给药第0、1、2、3、6、7周的上午给药后30分钟测定各组小鼠RBG;于给药第5周,测定胰岛素耐量;于第8周测定肝功能(ALT、AST、TP、ALB、GLB)、血脂(FFA、TG、TC、HDL-c、LDL-c)以及炎症因子(IL-1β、IL-18以及TNF-α)等指标;取肝脏组织甲醛固定、切片,HE染色和Masson染色,在光镜下观察病理学改变以及胶原蛋白沉积情况,戊二醛固定液固定以及重金属染色后透射电镜下观察肝细胞超微结构;应用免疫组化法、Western blot、RT-PCR等手段检测各组鼠肝脏组织中与糖脂代谢紊乱及炎症相关的关键因子INS-R、p-IRS-2、PI3K、p-AKT、GLUT4、PPARγ、NF-1(B和IKKβ蛋白/基因的表达。结果:1.AOS的制备工艺优化及其所含糖类成分分析的实验结果表明:(1)本实验中AOS提取的最佳工艺条件为:A2B2C3D1组合方案,即10、8、8倍量70%乙醇提取3次,依次回流2小时、1小时、1小时,此时低聚糖平均提取率为2.49%;AOS分离纯化的最佳工艺条件为:A2B2C3D1组合方案,即沙蓬上样总量为18 g,浓度为0.4g·mL-1,以1.0BV·h-1的流速,吸附4小时,低聚糖平均提取率为1.74%;AOS活性炭脱色的最佳工艺条件为A1B1C1D2,即碳粉用量为0.005 g·mL-1,温度50℃,时间30 min,样液浓度10 mg·mL-1,低聚糖平均保留率为82.26%,脱色为65.53%。(2)以AEC为衍生化试剂,对AOS进行柱前衍生,通过UPLC-Q-TOF/MSE分析,鉴定出葡萄糖、乳糖、芸香糖、葡萄糖醛酸和麦芽三糖5种糖类物质。其中葡萄糖醛酸含量最多为15.35 mg·g-1,其次为芸香糖(14.90 mg·g-1)和乳糖(8.08 mg·g-1),葡萄糖(1.38 mg·g-1)和麦芽三糖(0.12 mg·g-1)含量相对较少。2.考察AOS治疗糖尿病db/db小鼠的主要药效学研究这部分实验结果显示,db/db小鼠经过8周灌胃给药观察发现某些特点与文献报道不完全一致,空腹14~16小时血糖值高低差异大,禁食24小时后,有的小鼠血糖甚至低于3 mmol·L-1很不稳定,特别是雌性小鼠,但RBG及糖负荷后血糖明显升高。AOS干预后,明显降低db/db小鼠的RBG(P<0.001),对雄性小鼠的作用更明显;改善糖耐量,第1次给药后和给药8周后口服糖耐量测试(OGTT)结果基本一致(P<0.05,P<0.001);FPG、FINS均不同程度降低且IR明显改善(P<0.05,P<0.001);降低小鼠血中HbAlc(P<0.05)和AGEs;光镜下HE染色和Masson染色结果均显示了 AOS明显改善db/db小鼠胰腺组织病理损伤和纤维化程度;电镜下观察胰腺超微结构发现,AOS对糖尿病db/db小鼠胰腺胰岛β细胞超微结构改变有一定抑制作用或逆转作用;免疫组化法检测各组小鼠胰腺组织中胰岛素信号通路关键因子,发现AOS可上调INS-R、IRS-1、IRS-2和GLUT4的表达,为明确其降糖作用机制明确方向。3.本部分观察AOS对胰岛β细胞(MIN6)直接作用,结果表明AOS对胰岛MIN6细胞有促进增殖作用,可以促进高糖刺激下MIN6细胞胰岛素的分泌,并且减少高糖刺激下MIN6细胞凋亡,各药物浓度间没有明显量效关系,32 μg·mL-1浓度下的AOS对MIN6细胞作用更好,甚至强于32 μg·mL-1浓度下的MET。Western blot结果显示,32 μg.mL-1和64 μg·mL-1浓度的AOS可以不同程度上调高糖刺激后细胞中INS-R、IRS-1、IRS-2和GLUT4的蛋白表达水平,但RT-PCR结果与Western blot结果趋势不一致且基本无统计学意义,考虑mRNA翻译到蛋白质的过程中,可能存在其他因素的干预使其结果不完全一致具体机制还需后续深入研究;免疫荧光测定PTP1B蛋白表达结果显示,16 μg·mL-1和32μg·mL-1浓度AOS干预MIN6细胞后PTP1B的表达最低,其次为32 μg·mL-1浓度的MET。4.给药8周后,雄性db/db小鼠RBG显著下降,效果优于MET;通过胰岛素耐量实验可知,AOS可明显改善IR、增加胰岛素敏感性;AOS具有改善肝脏功能的作用,使db/db小鼠的ALT、AST水平显著降低(P<0.05,P<0.001);可不同程度地降低TG、TC、LDL-c、FFA(P<0.05,P<0.001),升高 HDL-c(P<0.05,P<0.001),改善脂代谢紊乱;可明显降低小鼠血清及肝脏组织中的炎症因子IL-1β、IL-18、TNF-α含量(P<0.05,P<0.001);通过HE染色、Masson染色及电镜观察结果,发现AOS可明显减轻db/db小鼠的肝损伤,HAOS作用更明显;免疫组化、Western blot和RT-PCR结果显示,AOS能上调db/db小鼠肝组织 PPARγ、INS-R、p-IRS-2、PI3K、p-AKT 及 GLUT4 蛋白和基因表达,HAOS 作用强于LAOS;对NF-κB、IKKβ蛋白和基因表达有抑制作用。结论:1.该AOS制备工艺方法科学可行、操作简单,所得AOS提取率及纯度较高,为沙蓬药材及其低聚糖的进一步开发奠定基础。2.通过UPLC-Q-TOF/MSE分析,鉴定出AOS中所含5种糖类物质,其中含量最多的是葡萄糖醛酸,其次是芸香糖和乳糖,葡萄糖和麦芽三糖含量相对较小。该方法可进一步为研究AOS的药效物质基础、阐明药理作用机制奠定基础。3.AOS通过抑制胰岛素负性调节因子PTP1B的表达,增加胰岛素信号通路INS-R/IRS/GLUT4信号转导起调节糖代谢紊乱,改善IR的作用,对T2DM有治疗作用。4.AOS对db/db小鼠T2DM-NAFLD的发生发展具有抑制作用,其机制是AOS上调脂代谢关键因子PPARγ,抑制炎症通路NF-κB、IKKβ信号因子表达,增加IRS-2和AKT蛋白的磷酸化,进而介导了胰岛素信号通路INS-R/PI3K/AKT/GLUT4的信号转导。