[研究背景]： 前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一，死亡率高居男性癌性死亡的第二位。发病隐匿和易转移是临床诊断和治疗前列腺癌的最大障碍。目前前列腺癌的病因尚不明确，可能与遗传、环境和性激素等多因素有关。前列腺癌特异膜标志物是实现生物诊断和生物治疗的基础，探索前列腺癌特异膜标志物在前列腺癌发生发展中的作用机制十分重要。 前列腺特异膜抗原(prostate—specific membrane antigen，PSMA)主要表达于前列腺上皮细胞膜表面，具有较高的前列腺癌特异性和膜结合特性，是近年来前列腺癌研究热点之一。PSMA是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，具有叶酸水解酶活性和NAALADase酶活性。PSMA在正常前列腺中低表达，在大多数前列腺癌组织中高表达，并随肿瘤进展而表达增高，在转移癌及激素不敏感型前列腺癌中表达进一步增高，提示PSMA可能与肿瘤的发生发展相关，但PSMA在前列腺癌中的具体作用及机制尚不明了。相关研究提示PSMA可能与前列腺癌的生长侵袭有关。 选择剪接是转录后修饰的一个普遍现象，是产生蛋白质多样化的重要机制之一，与人类多种疾病包括肿瘤的发生发展密切相关。PSMA也存在多种选择剪接形式，而且许多研究提示，PSMA的选择剪接与前列腺癌的发生发展密切相关。深入该领域的研究有利于揭示前列腺癌的发生机制，对寻求更加特异有效的前列腺癌诊治靶标具有重要意义。 PSM—F是本课题组近期发现的PSMA新型剪接变异体，经证实该序列在LNcap细胞天然表达，确认为一种新的PSMA变异体(Genebank号：EF488812)。它的发现无疑证实和丰富了PSMA剪接变异的多样性。为了进一步研究这种新的剪接变异体PSM—F，本研究拟排除PSM—F前段非编码区(UTR)的干扰，仅克隆其完整的开放读码框架，重新构建PSM—F的真核表达载体，记为pcDNA3.0/PSM—F’，并在真核细胞中进行表达，为后续的相关研究垫定实验基础。 [目的]： 1.构建PSMA新型剪接变异体PSM—F完整开放读码框架的真核表达载体pcDNA3.0/PSM—F’。 2.在真核细胞中表达PSM—F，PSM—F的成功表达将为进一步深入研究PSM—F打下坚实的基础。 [方法]： 1.本研究在前期工作基础上，以本实验室保存的pcDNA3.0/PSM—F质粒为模板，PCR扩增只包含PSM—F的完整开放读码框架的目的基因片段，构建真核表达载体pcDNA3.0/PSM—F’，经PCR、双酶切和碱基测序鉴定。 2.将鉴定阳性的pcDNA3.0/PSM—F’使用阳离子脂质体介导转染模型细胞CHO，转染pcDNA3.0空质粒作为阴性对照。G418筛选转染细胞，RT—PCR、间接免疫荧光和免疫印迹分别从基因水平和蛋白水平鉴定G418抗性细胞中有无目的蛋白表达。 [结果]： 1.测序结果表明目的片段在pcDNA3.0质粒中插入方向正确，序列与模板100％同源，说明pcDNA3.0/PSM—F’真核表达载体构建成功。 2.筛选出的G418抗性细胞克隆扩增后，RT—PCR鉴定结果：针对PSM—F设计的引物可从PSM—F/CHO细胞来源的cDNA和质粒pcDNA3.0/PSM—F’中扩出目的片段，而空质粒pcDNA3.0以及pcDNA3.0/CHO细胞来源的cDNA为模板只能扩出内参，无其他条带扩出，说明PSM—F在基因水平上有转录。免疫荧光结果及免疫印迹结果表明：重组质粒转染的CHO细胞中有目的蛋白的表达，并且具有完全抗原性，裂解PSM—F/CHO细胞提取的蛋白和PSMA单抗结合可显示较弱条带，与阳性对照LNCaP细胞的目的蛋白条带位置相同或接近。 [结论]： 1.成功构建了pcDNA3.0/PSM—F真核表达载体， 2.获得PSM—F表达阳性的CHO细胞株，为相关功能试验提供物质基础。 3.证实PSM—F可在真核细胞中表达蛋白，并具有完全抗原性。