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背景和目的:脑卒中(Cerebral stroke)是一组以脑部缺血或出血性损伤症状为主要临床表现的疾病,又称脑中风、脑血管意外,主要分为出血性脑卒中(脑出血或蛛网膜下腔出血)和缺血性脑卒中(脑梗塞、脑血栓形成),其中以缺血性脑卒中最为常见。脑卒中具有发病急、高病死率的特点,是全球第二大致死性疾病。生理条件下,正常脑血流量(Cerebral blood flow,CBF)维持在50~60 mL/100 g/min。当脑缺血发生时,CBF迅速下降,缺血核心区CBF低于7 mL/100 g/min,缺血核心区外的缺血半暗带区(Ischemic penumbra,IP),CBF维持在7~17 mL/100 g/min,脑组织呈低灌注状态。IP依靠脑的侧支循环,神经细胞尚未经历不可逆死亡,因此通过治疗恢复脑血流后神经细胞尚可存活。所以,及时的溶栓治疗对于挽救急性缺血性脑卒中病人的神经功能是至关重要的。《中国急性缺血性脑卒中诊治指南》中明确指出,对于缺血性脑卒中患者,应给予神经保护药物作为溶栓治疗的辅助治疗以改善神经功能。因此,揭示重要的信号分子及其相关信号通路,从而保护缺血半暗带区神经细胞,有利于神经保护治疗策略的制定。脑缺血(Cerebral ischemia)激活许多复杂的细胞信号级联反应,这些级联反应对细胞存活和多种刺激引起的损伤至关重要。丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase,MAPK)是一种广泛存在于真核细胞中的一类丝/苏氨酸蛋白激酶,可以将细胞外信号转移到细胞中,以使细胞能够对缺血缺氧作出应答。其中p38MAPK途径是其主要途径之一。在脑缺血再灌注损伤中,p38 MAPK信号转导途径被激活,其将细胞外刺激信号传递至细胞内,是传递介导细胞反应的细胞信息的重要途径。我国传统中药胡黄连(Rhizoma Picrorhizae),始载于《唐本草》,性味苦寒,其中胡黄连苷Ⅱ(Picroside II)为其主要有效成分,含量最高。本课题组前期研究显示,在大鼠脑缺血损伤急性期给予胡黄连苷Ⅱ治疗,可明显减轻皮质神经元超微结构损伤、减少神经细胞凋亡、缓解脑水肿、改善神经功能障碍,提示胡黄连苷Ⅱ可能具有抗炎、抗氧化、抑制神经细胞凋亡的保护作用。然而其参与相关调节作用的细胞和分子机制仍不清楚。为此,本实验试图通过建立大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注(Middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R)模型和人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)细胞氧糖剥夺/复氧(Oxygen glucose deprivation/Reoxygen,OGD/R)模型模拟脑缺血/再灌注损伤,探讨胡黄苷II对脑缺血/再灌注损伤的神经保护作用及其与p38信号通路的关系。方法:1.在体动物实验:成年健康雄性Wistar大鼠200只,SPF级,6月龄,体重230~250g。自然环境(昼/夜12h/12h)中,常规适应性喂养1周,按照随机对照原则,动物分为假手术组、模型组、胡黄连苷(Picroside,Picr)组、茴香霉素(p38激动剂,Anisomycin,An)组、An+Picr组、SB203580(p38抑制剂,SB)组和SB+Picr组。应用线栓法经颈外-颈内动脉建立大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注(MCAO/R)模型,改良神经功能评分(Modified neurological severity score,mNSS)和经颅多普勒局部脑血流量(Regional cerebral blood flow,rCBF)检测作为造模成功的标准。mNSS法评价大鼠神经行为功能,2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)检测脑梗死体积,苏木精伊红(Hematoxylin-Eosin staining,HE)染色和透射电镜(Transmission electron microscopy,TEM)观察缺血区皮质神经元的形态结构,原位末端标记法(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling assay,TUNEL)检测缺血区皮质神经细胞凋亡,免疫组织化学(Immunohistochemical staining,IHC)定性检测脑组织p-p38表达水平,Western Blot定量检测大鼠缺血皮质区p-p38、p-p53、IL-6和TNFα蛋白表达变化。2.体外细胞培养:利用SH-SY5Y细胞建立氧糖剥夺/复氧(OGD/R)模型,设置浓度梯度,探讨胡黄连苷II对OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞模型的最佳保护剂量。随后依据药物处理分为对照组、模型组、胡黄连苷(picroside,Picr)组、茴香霉素(p38激动剂,Anisomycin,An)组、An+Picr组、SB203580(p38抑制剂,SB)组和SB+Picr组。光镜下,观察细胞形态变化,细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK8)检测细胞活性,流式细胞术(Flow cytometry,FCM)、Cleaved Caspase-3蛋白表达检测细胞凋亡情况,免疫荧光(Immunofluorescence,IF)和Western Blot(WB)定性定量检测p-p38和p-p53蛋白表达情况,WB和ELISA检测IL-6和TNFα蛋白表达情况。结果:1.动物MCAO/R实验结果(1)神经行为功能变化:mNSS评分显示,模型组、An组和An+Picr苷组大鼠评分较高,显著高于对照组(P<0.01,n=20)。而胡黄连苷II、SB203580以及两者联合治疗后,大鼠mNSS评分较模型组显著下降(P<0.01,n=20)。(2)脑梗死体积变化:TTC检测显示,模型组、An组和An+Picr组大鼠出现大片白色梗死灶,胡黄连苷II治疗后,梗死体积较模型组明显下降(P<0.05,n=5)。而SB203580以及SB2035820与胡黄连苷II联合治疗后,梗死体积较模型组下降更为明显(P<0.01,n=5)。(3)细胞形态结构变化:HE检测显示,假手术组,大鼠皮质神经元排列整齐,结构完整。MCAO/R后,模型组、An组和An+Picr组大鼠神经元排列紊乱,细胞固缩深染,尤以An组最为明显。而Picr组、SB组以及SB+Picr组大鼠神经元损伤较轻,细胞结构完整,部分细胞形态不规则。(4)细胞超微结构变化:TEM检测显示,假手术组,大鼠皮质神经元结构完整,细胞质内含有各种细胞器。MCAO/R后,模型组、An组和An+Picr组大鼠神经元双层核膜不清,胞浆细胞器溶解消失。而Picr组、SB203580组以及SB+Picr组大鼠神经元损伤较轻,细胞结构完整,核膜不清。(5)细胞凋亡变化:TUNEL检测显示,模型组和An组大鼠凋亡细胞较假手术组显著升高(P<0.01,n=5),Picr组、An+Picr组、SB组和SB+Picr组大鼠凋亡细胞较模型组明显降低(P<0.05,n=5)。(6)p-p38蛋白表达变化:WB和IHC检测显示,假手术组,p-p38蛋白表达较低,呈弱阳性。MCAO/R后,模型组、An组、An+Picr组p-p38表达较假手术组明显升高,呈强阳性(P<0.01,n=5)。Picr组、An+Picr组、SB组和SB+Picr组大鼠p-p38蛋白较模型组显著降低,呈弱阳性(P<0.05,n=5)。(7)p-p53蛋白表达变化:WB检测显示,假手术组,p-p53蛋白表达较低。MCAO/R后,模型组、An组p-p53蛋白表达升高,显著高于假手术组(P<0.01,n=5)。Picr组和An+Picr组p-p53蛋白较模型组有所降低(P<0.05,n=5),SB组和SB+Picr组蛋白表达较胡黄连苷组进一步下降,但无统计学差异(P>0.05,n=5)。(8)IL-6蛋白表达变化:WB检测显示,MCAO/R后,模型组、An组和An+Picr组IL-6蛋白表达升高,与假手术组相比,有统计学差异(P<0.01,n=5)。Picr组、SB组和SB+Picr组IL-6蛋白表达较模型组明显降低(P<0.05,n=5),接近假手术组(P>0.01,n=5)。(9)TNFα蛋白表达变化:WB检测显示:MCAO/R后,模型组和An组TNFα蛋白表达升高,显著高于假手术组(P<0.01,n=5)。Picr组和An+Picr组TNFα蛋白表达较模型组降低,但无统计学差异(P>0.05,n=5)。2.SH-SY5Y细胞OGD/R实验结果(1)OGD/R模型建立:依据CCK8检测结果,缺氧4 h~6 h时,细胞损伤较轻,细胞可通过自身修复。而缺氧时间达到12 h时,细胞损伤过重,仅有少量细胞存活。缺氧8 h时,细胞约有50%~60%的细胞存活。根据细胞存活率,我们最终选取缺氧8h,复氧4 h进行下游实验。(2)胡黄连苷II的浓度优化:依据CCK8检测和光镜下观察细胞形态,经20、50和100μg/mL胡黄连苷II处理后,SH-SY5Y细胞存活率明显升高,各浓度梯度细胞存活率差异不明显(P>0.05),故选取20μg/mL的胡黄连苷II进行下游实验。(3)细胞存活率:CCK8检测和光镜下观察显示,OGD/R后,模型组、An组和An+Picr组SH-SY5Y细胞受损严重、突起消失、细胞变圆,细胞存活率明显降低(P<0.01,n=6),经胡黄莲苷II、SB2035820以及二者联合干预后,SH-SY5Y细胞形态恢复,细胞存活率较模型组显著升高(P<0.01,n=6)。(4)凋亡细胞变化:FCM检测显示,OGD/R后,模型组出现大量细胞凋亡,经茴香霉素处理后凋亡细胞数量进一步增多,但与模型组相比无统计学差异(P>0.05,n=5)。而经胡黄连苷II和SB2035820以及二者联合干预后,凋亡细胞数量较模型组显著降低(P<0.05,n=6).(5)Cleaved Caspase-3蛋白表达变化:WB检测显示,对照组,Cleaved Caspase-3蛋白微弱表达。OGD/R后,模型组、An组Cleaved Caspase-3蛋白表达较对照组明显升高,呈强阳性(P<0.01,n=6),Picr组、An+Picr组、SB组和SB+Picr组细胞Cleaved Caspase-3蛋白较模型组显著降低,呈弱阳性(P<0.01,n=6)。(6)p-p38蛋白表达变化:WB和IF检测显示,对照组,p-p38蛋白微弱表达。OGD/R后,模型组、An+Picr组p-p38蛋白表达较对照组明显升高,呈强阳性(P<0.01,n=6),而An组p-p38蛋白表达较模型组进一步增强(P<0.01,n=6)。Picr组、SB组和SB+Picr组细胞p-p38蛋白较模型组显著降低,呈弱阳性(P<0.01,n=6)。(7)p-p53蛋白表达变化:WB和IF检测显示,对照组,p-p53蛋白表达呈弱性。OGD/R后,模型组、An组、An+Picr组p-p53蛋白表达较对照组明显升高,呈强阳性(P<0.01,n=6)。Picr组、SB组和SB+Picr组细胞p-p53蛋白表达较模型组显著降低,呈弱阳性(P<0.01,n=6)。(8)IL-6蛋白表达变化:WB检测显示,OGD/R后,模型组、An组和An+Picr组IL-6蛋白表达较对照组明显升高(P<0.01,n=6)。Picr组、SB组和SB+Picr组细胞IL-6蛋白较模型组显著降低P<0.01,n=6)。ELISA检测细胞上清液显示,对照组,IL-6蛋白分泌较少。OGD/R后,模型组、An组和An+Picr组IL-6蛋白分泌较对照组明显升高(P<0.01,n=6),Picr组、SB组和SB+Picr组细胞IL-6蛋白分泌较模型组显著降低(P<0.01,n=6)。(9)TNFα蛋白表达变化:WB检测显示,OGD/R后,模型组TNFα蛋白表达较对照组显著升高(P<0.05,n=6),经胡黄连苷II处理后,TNFα蛋白表达降低不明显(P>0.05,n=6)。An组和An+Picr组TNFα蛋白表达较模型组进一步上升(P<0.01,n=6),而SB组和SB+Picr组可完全逆转表达增强的TNFα,接近于对照组水平(P>0.05,n=6)。ELISA检测细胞上清液显示,对照组,TNFα蛋白分泌较少。OGD/R后,模型组、An组和An+Picr组TNFα蛋白分泌较对照组明显升高(P<0.01,n=6),Picr组TNFα蛋白分泌较模型组降低,但无统计学差异(P>0.05,n=6),SB组和SB+Picr组细胞TNFα蛋白分泌较模型组显著降低(P<0.01,n=6)。结论:在体动物实验和体外细胞培养证实,脑缺血/再灌注(氧糖剥夺/复氧)损伤可通过活化p38信号通路引发细胞凋亡和炎症反应,而胡黄连苷Ⅱ可通过抑制p38-p53信号通路减轻脑缺血/再灌注损伤后的炎症反应,发挥神经保护作用。