胚胎干细胞(Embryonic stem cell, ESC)取自于着床前的囊胚内细胞团,具有无限增殖的自我更新能力和分化为包括生殖系在内的机体全部类型组织细胞的全能性。在一定的体外培养条件下,胚胎干细胞可以分化为心肌细胞、胰岛p细胞、神经细胞等多种类型的体细胞。胚胎干细胞全能性的特点,使其不仅为研究机体的发育机制和基因功能提供了良好的平台,也在细胞替代治疗等新兴疾病治疗手段中具有广阔的应用前景。哺乳动物在生物进化程度上更加接近于人类,是研究基因功能和疾病致病机理的良好模型。哺乳动物疾病模型,如啮齿类的小鼠、大鼠疾病模型,猪的疾病模型和非人灵长类的猴子模型等,在对基因的功能和作用机制的探索、新药研发及人类疾病的发病机理的研究和治疗等方面发挥着非常重要的作用。要获得遗传修饰的哺乳动物疾病模型需要同时具备以下两个因素：一方面是对遗传物质基因组DNA进行遗传修饰,常见的技术包括物理、化学和病毒或者质粒介导的随机插入、转座子系统介导的基因捕获、同源重组和位点特异性核酸内切酶介导的基因编辑等；二是将遗传修饰拓展到个体水平并能够通过生殖系传递到下一代,常见的技术包括胚胎原核注射、体细胞核移植、胚胎干细胞介导的生殖系嵌合以及单倍体胚胎干细胞替代精子与卵母细胞融合产生个体等。近几年发展起来的位点特异性核酸酶介导的基因编辑技术,是一种定向改造基因组的遗传修饰技术,是进行基因组改造和探索基因功能的关键技术手段之一。目前常用的基因编辑技术主要包括ZFN (Zinc-finger nucleases)、TALEN (Transcription activator-like effector nucleases)和CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas9。其中CRISPR-Cas9技术由于构建简单、使用方便、周期短、基因编辑效率高而且价格便宜,已经被广泛应用于基因修饰的干细胞系的建立和哺乳动物疾病模型的获得。其主要原理是通过gRNA利用碱基互补配对靶向目的位点,引导Cas9在该位点进行切割从而产生DNA双链断裂(Double strand break, DSB),进而诱发内源性的细胞修复机制,通过同源重组修复(Homologous directed repair, HDR)或非同源末端连接(Non-homologousend-joining NHEJ)将断裂的双链DNA连接起来,通过不同的修复方式以及利用设计好的带有同源区段的供体质粒或寡核苷酸片段,就可以实现基因敲除、外源基因或片段的定点插入、基因特定位点的定点突变以及染色体的大片段缺失和重排等遗传修饰。根据文献报道,NSun2基因是一种RNA甲基化转移酶,能够在tRNA的胞嘧啶第5位的C原子上进行甲基化修饰(5mC),促进tRNA的稳定性和蛋白质的生物合成,并能够抑制Myc基因诱导的肿瘤增殖,对精子发生也具有非常重要的作用。另有报道称NSun2基因异常会产生常染色体隐性的智力障碍。MRNA的甲基化修饰主要发生在腺苷酸第6位的N原子上(m6A),m6A修饰对mRNA的剪切,稳定性,细胞内的定位,翻译等具有非常重要的作用。因而我们推测mRNA的m5C修饰也可能具有非常类似的功能,研究NSun2对mRNA的5mC甲基化修饰的作用将有助于我们弄清楚NSun2基因发挥功能的分子机制。为此我们利用CRISPR技术建立了NSun2基因纯合敲除的胚胎干细胞(ESC)和小鼠动物模型,为后续的基因功能和分子机制的的探索、胚胎干细胞的重编程以及对小鼠的发育和代谢等研究提供了基础。