论文部分内容阅读
粘细菌是一类具有复杂多细胞社会性行为高等原核生物,能够在固体表面滑行,通过群体协作的方式实现对细菌捕食。作为一种具有良好土壤定殖能力的土著微生物,粘细菌在调节土壤中微生物群落的组成和动态分布方面具有重要的作用。目前对于粘细菌的研究多数集中在其基础的发育学特征,包括运动性、子实体结构的形成以及细胞的自我识别机制等方面,而利用粘细菌的捕食特性实现对包括植物病原细菌在内的有害微生物防治方面的研究则相对较少,因此利用捕食性粘细菌实现对病原菌的防治具有潜在的应用价值。本研究通过对分离到的多株粘细菌进行筛选,获得了一株对植物软腐病胡萝卜软腐果胶杆菌（Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum,简称Pcc）具有良好捕食特性的生防粘细菌BS,经鉴定为Myxococcus sp.,并以该菌株为材料,对其生防潜力和涉及到的作用机制进行了详细的研究。本研究通过兔粪和酵母诱导子实体的方法从采集的土壤中分离纯化出12株粘细菌。根据生理生化、16S rDNA序列比对分析及子实体形态观察,分离获得的12株粘细菌分别为原囊菌属（Archangium sp.）（6株）、粘球菌属（Myxococcus sp.）（4株）以及珊瑚球菌属（Corallococcus sp.）（2株）。将分离得到的粘细菌与胡萝卜软腐果胶杆菌Pcc进行共培养,并对粘细菌捕食后的Pcc残存的活细胞进行计数,最终筛选得到一株捕食Pcc能力较强的粘细菌Myxococcus sp.BS。菌株BS对梨火疫病菌、番茄青枯病菌、梨伤流溃疡病菌、菊欧文氏病菌、黑胫病菌以及马蹄莲软腐病菌等多种植物病原细菌均具有较强的捕食能力。盆栽实验表明,菌株BS可以有效地抑制胡萝卜软腐果胶杆菌对土豆和马蹄莲的侵染,降低植物的发病率。土豆块茎侵染实验中,对照组中小土豆的腐烂率第5天为45.1%,第10天为96.7%,BS和Pcc混菌接种处理组中的土豆块茎第5天未发病,第10天的发病率为18.4%,防治效果为81%,农用链霉素防治效果则是8.2%。马蹄莲盆栽实验结果表明,菌株BS菌悬液处理组的植株发病率从对照组的75.0%下降到19.8%,病情指数从对照组的62.5%降至6.3%,同时也观察到菌悬液处理组马蹄莲的新生种球数量增加。以上表明菌株BS对软腐病具有良好的生防潜力。基于Myxococcus sp.BS对软腐病菌良好的生防效果,本研究结合标准菌株M.xanthus DK1622对其捕食病原细菌的作用机制进行了初步的研究。细菌滤膜隔离实验以及菌株BS发酵上清处理Pcc后的活细胞计数结果均表明,粘细菌BS所分泌的次级代谢物或者酶类具有一定抑菌的作用,但是与菌株BS直接捕食病原细菌相比较作用是次要的,说明粘细菌BS对Pcc的高效捕食需要通过Predator-prey相互直接接触的方式来实现。基于以上实验结果表明,捕食者和食物之间的细胞接触在粘细菌捕食病原细菌过程具有至关重要的作用。根据文献报道,细胞间的物质运输主要包括VI型分泌系统（T6SS）、囊泡（Vesicles）、IV型分泌系统（T4SS）、纳米管（Nanotubes）、Allolysis以及脂蛋白转移等,通过对粘细菌基因组分析并结合其捕食特性,我们推测T6SS和囊泡在粘细菌捕食过程中可能具有重要作用。以M xanthus DK1 622为材料,对其T6SS合成基因簇进行研究,发现菌株DK1622基因组中仅存在一套T6SS合成基因簇,该基因簇由13个蛋白组成,其中MXAN4807-MXAN4813构成了 T6SS结构的核心元件。研究发现,关键基因clp V1和vrgG插入失活影响了粘细菌的扩散捕食速度,但是最终依然能够通过群体的方式对Pcc进行捕食,说明T6SS在粘细菌捕食中具有一定的作用,但并不占主导地位。为了进一步验证囊泡在粘细菌捕食中作用,本研究将菌株BS和Pcc共培养,并通过电镜观察菌体形态,结果发现同培养时粘细菌菌体周围分泌了大量的外膜囊泡,同时部分囊泡附着在病原细菌Pcc细胞周围。进一步提取粘细菌DK1622胞外囊泡并对其捕食Pcc能力进行验证发现M xanthus DK1622分泌的胞外囊泡具有抑制Pcc的能力,计数结果显示经过囊泡处理后的Pcc活菌数量仅为原始的37%。结合已有报道,囊泡内部包含有多种水解酶类以及具有抗菌活性的次级代谢物,说明囊泡在粘细菌捕食病原细菌方面具有重要的作用。本研究结果表明粘细菌通过直接接触的方式显示对病原细菌的捕食,并验证了 T6SS和外膜囊泡在捕食过程中的作用,但T6SS关键位点依然需要进一步研究。