雷帕霉素靶标(TOR)是一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,能够通过整合营养、能量和生长因子来调节转录、蛋白翻译、代谢过程及细胞自噬等分子活动,在细胞的增殖、生长和代谢过程中起着中心调节作用。TOR激酶作为是营养、能量和压力信号网络的主调控器,在所有真核生物(如酵母、植物、动物和人类)的进化中是高度保守的。相对于酵母和动物等异养生物,植物能通过光合作用来完成光合自养生长,并且有着自身特有的激素信号调节途径。但是,目前对于TOR在植物光合自养生长和植物激素方面的调节作用却少有研究和报道。本文通过结合遗传学、转录组测序以及生物化学和分子生物学方法,揭示了TOR在调节植物光合生长中的重要功能,并建立起TOR-S6K2-BIN2信号途径调节模式,将TOR信号途径与植物油菜素内酯(BRs)信号途径通过BIN2联系起来。本研究得到以下结果和结论:(1)在本文中,选择和比较了不同的靶向TOR激酶结构域抑制剂(as TORis,如AZD8055、Torin1和KU0063794)对植物生长发育的影响,发现所选择的as TORis都能够有效的抑制植物的生长,降低植物的生物量并抑制根的延长,并且是浓度依赖性的抑制方式。此外,还观察到高浓度的抑制剂处理,会导致拟南芥种子萌发后出现不能完成由异养到光合自养的转变而停止生长的表型,且幼苗期的抑制会导致叶片黄化和衰老的表型,以及RNA总量的下降。表明了as TORis不仅能有效的抑制拟南芥的生长,还暗示着TOR能够影响植物异养到光合自养转变以及光合自养生长过程。(2)进一步通过转录组测序分析了拟南芥幼苗TOR在2μM AZD8055抑制条件下整体基因的表达特征。数据分析结果显示,有2780个基因发生了显著的差异表达,这些差异表达基因(DEGs)大部分显著富集404个GO terms中和96个KEGGs信号或代谢途径中。在TOR保守的调节功能方面,如核糖体的生物合成、氨基酸、糖、脂质代谢以及自噬的调控等都有显著的富集。既说明其在真核生物中调节功能的保守性,也反映出AZD8055对拟南芥TOR抑制的选择特异性以及高效性。(3)此外,还发现大量DEGs富集在光合作用相关的GO terms和代谢途径,如叶绿体组分、叶绿体核糖体、叶绿体内囊体等,以及光合作用中光反应和碳固定途径,而且这些DEGs大部分表现出下调表达。在植物激素方面,还发现大量涉及植物激素信号途径相关的DEGs,如Auxin、CK、GA、Ethylene、BR、JA和SA等)相关的基因,其中Auxin、CK和BR等参与调节生长发育或合成代谢途径相关基因大部分都表现出下调,而Ethylene、JA和SA等涉及逆境响应或衰老等分解代谢相关基因的表达基本表达上调。这些结果表明TOR信号与植物激素信号途径之间存在密切而复杂的调控网络,且TOR还参与植物的光合作用进而调节植物的光合自养生长。(4)在对雷帕霉素(RAP)敏感性材料BP12-2进行药物处理时,发现RAP联合asTORis能够显著的提高对BP12-2材料的生长抑制。在各个药物的IC50下,相对于单个药物或as TORis之间的联合使用,RAP+as TORis的结合使用能够显著的加强抑制效果。进一步计算和分析药物效应联合指数(CI),发现RAP+as TORis有着非常低的CI值(CI<1),表明RAP+as TORis能够产生强的协同抑制效应,而as TORis之间则是剂量上的加性效应(CI=1)。因此,本研究在植物TOR研究中建立起高效率和高选择性的TOR抑制系统,不仅能够提高抑制效率,同时也降低药物的使用剂量。(5)此外,在各抑制剂IC50下,观察到RAP+as TORis的结合使用,能够导致拟南芥BP12-2材料不能够完成由异养生长到光合自养生长的转变而保持一种生长停止状态表型。而且这种生长停止状态是可逆的,当解除TOR抑制后,停止生长幼苗又能重新分化出叶绿体、真叶和根,表明TOR在这种转变中涉及对细胞分化的调节。透射显微镜观察显示,在由TOR抑制所导致生长停止的幼苗子叶中,仅能观察到大量的造粉体和淀粉粒,而并不能观察到叶绿体或者其前体,如原质体和白质体等。进一步通过幼苗处理的结果也显示,TOR抑制情况下,大量的淀粉粒积累在幼苗真叶的叶绿体中,而且光合基因、叶绿素合成和代谢中标志基因都表现出显著的变化。这些观察结果表明,拟南芥TOR调节植物的光合自养生长过程中,一方面可能涉及调节叶绿体的形成或分化,而另一方面也可能是通过调节淀粉的代谢。(6)在以RAP+as TORis高效的选择抑制的基础上,发现TOR保守的下游底物S6K2表达量的提高能够互补BP12-2光合自养生长停止表型,而S6K1的表达量的提高却不能互补,表明TOR是通过S6K2,而不是通过S6K1信号途径,来调节植物光合自养生长的。通过Western检测,发现TOR调节S6K2磷酸化水平,TOR的活性降低直接导致S6K2磷酸化水平的下调。进一步证明TOR调节光合自养生长是通过下游底物S6K2途径。(7)通过酵母文库筛选,发现BIN2可能作为S6K2的下游效应子;进一步通过蛋白免疫共沉淀方法(CO-IP)证明S6K2与BIN2在植物中能发生直接的相互作用。并且体外激酶实验也证明S6K2能够与BIN2互作并直接磷酸化BIN2;通过蛋白质凝胶迁移实验(Gel Shift)证明S6K2磷酸化BIN2依赖于TOR信号。进一步通过药物处理实验和表型分析证明BIN2能够作为TOR-S6K2的下游效应因子,负调节植物光合自养生长。这些结果表明TOR在调节植物光合自养生长方面可以通过S6K2-BIN2信号途径。最终在植物中建立起TOR-S6K2-BIN2的调节模式,从分子机制上揭示TOR在调节植物由异养到光合自养生长过程中的重要功能。