研究目的:库欣病是由于垂体促肾上腺皮质激素（AC’TH）腺瘤产生过多ACTH,导致肾上腺皮质分泌过多糖皮质激素（皮质醇）的一种疾病,其复发率高,高皮质醇血症引起的并发症累及全身多个系统,患者预后很差。糖皮质激素受体（GR）由Nuclear Receptor Subfamily 3 Group C Member 1（NR3C1）基因编码,在垂体 ACTH 分泌细胞的负反馈调节中发挥重要作用。本课题组前期研究在4例库欣病患者的垂体ACTH腺瘤中发现体细胞NR3C1基因突变,突变位点为c.1405C>T（p.R469*）,c.2077T>G（p.Y693D）,c.2173A>G（p.M725V）和 c.2098G>C（p.A700P）,c.1769A>G（p.D590G）和 c.1750T>G（p.F584V）。本研究旨在验证 NR3C1 基因突变 c.1405C>T（p.R469*）、c.1769A>G（p.D590G）、c.2077T>G（p.Y693D）对于 GR 蛋白的功能的影响,进一步探索NR3C1基因突变在垂体ACTH腺瘤发生机制中的作用。研究方法:收集库欣病患者临床资料,并对其手术切除的肿瘤标本进行免疫组化研究。构建野生型和突变型NR3C1基因的表达质粒,通过阳离子脂质体瞬时转染技术,将野生型和突变型质粒表达载体转染至小鼠垂体瘤细胞（AtT-20）,观察野生型和突变型GR蛋白在AtT-20细胞中的表达和定位差异。在此基础上,检测野生型和突变型NR3C1质粒转染AtT-20细胞后,Pomc mRNA和POMC蛋白水平的变化;进一步将野生型和突变型NR3C1表达载体分别与含有P0MC基因启动子序列的萤光素酶报告载体共转染,通过检测双萤光素酶的活性,研究野生型和突变型GR蛋白对POMC启动子的活性的影响。研究结果:1.GR蛋白在垂体腺瘤组织中的表达特征与临床相关性垂体ACTH腺瘤的GR蛋白组织水平表达显著高于其他垂体腺瘤病理亚型。NR3C1基因突变患者肿瘤组织的GR蛋白表达相对较高。GR免疫组化染色强度与患者年龄、肿瘤最大径、发病年龄、术前及术后血总皮质醇和ACTH水平均无显著相关性。复发性垂体ACTH腺瘤的GR免疫组化评分显著高于非复发组（p=0.0023）,评分大于27.22时,判断复发性的诊断敏感性为50%,特异性为79.41%。GR蛋白免疫组化染色强度与术后肿瘤复发时间间隔呈正相关关系,相关系数r=0.4769（p=0.0454）。2.含有目标突变的pcDNA3.1（+）-mut-NR3C1表达载体的构建比对突变型质粒测序结果与野生型模板序列（NM₀00176.2）,目标突变c.1405C>T（p.R469*）、c.1769A>G（p.D590G）、c.2077T>G（p.Y693D）突变位点正确,除突变位置外,其余序列与野生型基因序列一致。3.细胞水平野生型和突变型GR蛋白表达和定位差异蛋白免疫印迹实验发现,相较于野生型GR蛋白,p.D590G和p.Y693D突变型GR蛋白水平均显著减低,p.R469*突变为无义突变,所表达的GR为截短蛋白。免疫荧光染色实验发现,p.R469*、p.D590G和p.Y693D突变型GR蛋白在细胞核中的分布较野生型明显减低。4.野生型和突变型GR蛋白过表达对于P0MC基因表达的影响GR蛋白对于POMC启动子的抑制作用呈剂量依赖性模式,且受配体浓度的影响,随着GR蛋白水平增多、配体浓度的升高,POMC转录水平逐渐减少。在三种野生型GR蛋白+配体的作用下,共转染的POMC启动子报告质粒表达萤光素酶没有被抑制。无配体处理时,突变型p.R469*和p.D590G质粒转染组AtT-20细胞的Pomc mRNA和POMC蛋白水平显著高于野生型质粒转染组。5.野生型和突变型GR蛋白过表达对于增殖相关基因表达的影响过表达GR蛋白的AtT-20细胞中Cables1 mRNA水平显著降低,但野生型和突变型组间无显著差别,经过地塞米松处理后,野生型和突变型GR蛋白过表达组的Cablesl基因转录水平均显著升高,但组间无明显差别。研究结论:垂体ACTH腺瘤组织中GR蛋白表达显著高于其他类型垂体腺瘤,复发性垂体ACTH腺瘤的GR蛋白表达显著升高。野生型NR3C1和突变型NR3C1在AtT-20细胞中存在表达差异,突变型p.D590G和p.Y693DGR蛋白的表达量较野生型显著减少,p.R469*GR蛋白为截短蛋白。三种突变型GR蛋白在配体作用下进入细胞核的能力受损。野生型和突变型GR蛋白对POMC基因表达的调控作用存在差异,三种野生型GR蛋白在与配体的作用下,抑制POMC转录的能力减弱,未经配体处理时,突变型p.R469*和p.D590G GR蛋白使POMC基因表达增多。GR蛋白过表达可减少AtT-20细胞中Cables1基因的表达,野生型和突变型GR蛋白对Cables1基因的调控没有显著差异。