论文部分内容阅读
H7N9流感病毒能够导致人类发病和死亡,自2013年在我国出现起一直在国内流行。2017年出现高致病性H7N9流感病毒（HPAIH7N9）,该病毒的HA片段裂解位点插入了四个连续氨基酸,获得对鸡的高致病性和高致死率,同时,HPAIH7N9病毒感染人的病例也在我国被发现,与低致病性H7N9流感病毒（LPAIH7N9）相比人感染死亡率进一步提升,故研发人用储备疫苗,有效控制H7N9流感病毒的流行已刻不容缓。人感染H7N9病例治疗中发现,部分H7N9流感患者出现继发性细菌感染,然而,对细菌和H7N9流感病毒在人感染病例中的协同作用研究数据十分有限,有必要进一步澄清细菌与H7N9流感病毒的协同致病、致死作用。因此,本文进行了:一、对H7N9/AAca弱毒疫苗阻止H7N9流感病毒复制的免疫保护力评价。H7N9/AAca是由反向遗传技术构建的重组弱毒疫苗,其携带人分离株A/Anhui/1/2013（H7N9）（AH/1）的表面基因HA和NA,以及冷适应流感毒株A/AnnArbor/6/60（H2N2）（AAca）的6个内部基因。本研究使用小鼠模型评价了 H7N9/AAca疫苗对异源HPAI H7N9 病毒（CK/S1220 和 CK/SD008-PB2/627K）和 LPAIH7N9 病毒（CK/SD057）的保护效力。对SPF级6W BALB/c小鼠经鼻腔接种106 EID50 H7N9/AAca疫苗,进行一次免疫和二次免疫,间隔三周,免疫后21d采血检测中和抗体水平,同时进行攻毒试验,经鼻腔感染 100 X MLD50 CK/S1220 病毒、100 X MLD50 CK/SD008-PB2/627K 病毒或100×MID50 CK/SD057病毒,3d后采样（鼻甲、肺、脾、肾、脑）接种鸡胚测定病毒含量。结果显示,一免后小鼠产生的抗H7N9/AAca、CK/S1220、CK/SD008-PB2/627K和CK/SD057病毒的中和抗体水平分别为65、13、20和17,攻毒后不发生死亡,仅免疫一次能够完全阻止高致病性CK/S1220和CK/SD008-PB2/627K病毒引起的发病和死亡,但不能阻止HPAI H7N9病毒在小鼠体内复制;能够阻止LPAI H7N9 CK/SD057病毒在小鼠体内复制。二免后,中和抗体水平分别上升为320、110、160和140,仅在鼻甲和肺中检测到含量极低的CK/SD008-PB2/627K病毒,感染CK/S12201的小鼠脏器内未检测到病毒。结论,一次免疫能够阻止HPAIH7N9流感病毒在小鼠上引起的发病和死亡,两次免疫完全阻止或显著降低（P<0.001）HPAIH7N9流感病毒在小鼠体内复制。二、H7N9/AAca弱毒疫苗阻止HPAIH7N9病毒传播的保护效力研究。106 EID50 H7N9/AAca疫苗经鼻腔接种SPF豚鼠,免疫后21d进行飞沫传播试验。传播试验分为两组,一组中免疫豚鼠作为感染动物接种106 EID50 CK/SD008-PB2/627K病毒,24h后将未免疫豚鼠放入相邻笼具;另一组中未免疫豚鼠感染106 EID50 CK/SD008-PB2/627K病毒,24h后将免疫豚鼠放入相邻笼具,每隔1d采集鼻洗液接种鸡胚,若检测到病毒即判定为感染。结果,免疫和未免疫的感染组豚鼠鼻洗液中检测到病毒含量较高的病毒,而两组传播试验的暴露动物均未被感染,因此仅免疫一次H7N9/AAca疫苗就可以有效的阻止CK/SD008-PB2/627K病毒在豚鼠间通过飞沫传播。三、H7N9流感病毒与细菌感染在小鼠模型中协同致死作用研究。研究使用2013年分离的PG/S1421和AH/1病毒,106 EID50 PG/S1421和106 EID50 AH/1流感病毒分别感染6W C57BL/6小鼠,PG/S1421病毒不能够引起小鼠体重下降和死亡,而AH/1病毒则在9d内杀死了所有小鼠。感染后7-8d,对入侵小鼠下呼吸道细菌平板计数,并进行细菌分离鉴定,结果显示PG/S1421病毒感染的小鼠下呼吸道无细菌继发感染,AH/1病毒感染小鼠下呼吸道有大量细菌入侵,包含五个种属细菌,葡萄球菌（Staphylococcus）、肠杆菌（Enterobacter）、克洛诺杆菌（Cronobacter）、埃希氏菌（Escherichia）和链球菌（Strepotococcus）。通过将分离到的五株细菌分别以108CFU浓度与亚致死剂量的104 EID50 AH/1病毒共同感染小鼠,发现葡萄球菌和肠杆菌与AH/1病毒的共感染组中5只小鼠死亡4只,链球菌与AH/1病毒的共感染组中5只小鼠全部死亡。因此葡萄球菌、肠杆菌和链球菌与AH/1病毒表现出的协同致病、致死效应,其中链球菌与AH/1病毒的协作导致小鼠的发病和死亡最为严重。此外,研究还发现,当小鼠在感染AH/1病毒前3d受到链球菌攻击,造成5只小鼠中2只死亡,且存活小鼠体重有恢复趋势;而小鼠在感染AH/1病毒后3d受到链球菌攻击时,小鼠则全部死亡。因此,只有当AH/1病毒先于或同时与链球菌攻击小鼠才能表现出协同致病、致死的效应。综上所述,H7N9/AAca冷适应弱毒活疫苗对HPAI H7N9病毒和新发现的LPAI H7N9病毒有良好的免疫保护性,可以成为有效的人用备用疫苗株;细菌与H7N9病毒有协同致死作用,治疗H7N9流感患者的方案中应该对非致病菌更加重视,尤其是链球菌,在怀疑病患为H7N9流感病毒感染者时需尽早使用抗生素作为辅助治疗。