研究背景：肺癌是最常见的一种癌症,已成为癌症死亡的首要原因。它的进展同肿瘤血管在乏氧条件下的增殖呈正相关。众所周知,VEGF通过与受体结合,在肿瘤血管生成中扮演了重要角色,在一些临床前期肿瘤模型中抑制VEGF途径可以抑制肿瘤的生长。VEGFR1和VEGFR2是VEGF的两个主要受体,突出表达于血管内皮细胞。肿瘤细胞释放VEGF可以上调VEGFR1/VEGFR2的表达。许多数据表明VEGFR2对VEGF活性的起负性调节作用,尽管VEGFR2 是 VEGF生物效应的主要调节器。然而,几项研究提示肺癌中VEGF/VEGFR1/VEGFR2的表达并不一定意味着一个功能性VEGF信号通路。并不是所有的肺癌都对VEGF受体阻滞剂有反应,其中一些最初对其有反应的,可能在治疗过程中变为耐药,出现胃肠道反应、出血和其它副作用。因此,探索其它的血管生成信号通路作为治疗的靶区就变得非常重要。Delta样配体4 (D114)/Notch信号通路被认为是另一种重要的血管生成通路。膜D114同相邻细胞的Notch受体结合在一起,从而导致Notch受体解离、释放它的胞内部分(Notch-IC),而这是转入细胞核内进行的。在细胞核内Notch-IC和具有高度保守性的转录因子CSL (CBF1/Suppressor of Hairless/Lagl)及MAML家族的转录共活化因子组成一种三元复合体。这种复合体激活包括Hesl和Heyl在内的靶基因的转录,调节血管内皮细胞的分化和增殖。一些研究表明在小鼠异体移植瘤、人乳腺癌和肾癌血管的肿瘤血管的D114表达增加,而正常血管很少表达或不表达。Patel等研究表明D114抑制剂可以诱导肿瘤血管内皮细胞细胞周期阻滞、凋亡增加和肿瘤血管增生减少,进一步证明了D114在肿瘤血管生成中的促进作用。然而,另一项研究表明D114可能在肿瘤血管生成中发挥抑制作用。当D114信号被抗体或siRNA阻滞时,可能会促进肿瘤血管内皮细胞增殖、发芽和分支,肿瘤血管密度显著增加。然而,D114/Notch通路在肺癌血管生长的作用还有待阐明。VEGF诱导D114表达的显著增高,促进肿瘤血管生长,阻断VEGF的表达导致D114急剧下跌和内皮细胞生长的抑制,这些表明了D114表达是受VEGF调节的。然而,研究已经表明D114高表达也可以抑制VEGF。D114在血管内皮细胞过表达会降低VEGFR2的表达,消弱血管内皮细胞对VEGF诱导的血管生长的反应,抑制血管生长,同时当D114被抑制时,VEGFR3的表达是增加的,血管生长是被促进的。因此推测VEGF和D114/Notch通路之间存在一个负反馈回路。乏氧已被认为是血管生成的另一个调节者,是很多实体瘤的标志。最近的研究表明在D114/Notch信号通路和HIF1α之间存在重要的互动。几个研究组已证实D114的水平在低氧环境下是升高的(0.1%)。Notchl似乎上调HIF1α的表达,HIFlα结合并稳定的活化Notch1导致增强的Notchl信号。为了了解VEGF和D114/Notch通路在乏氧条件下肺癌发病机制、进展和预后中的角色,我们测试了其信号通路分子的表达,评估了它们的临床关联。目的：研究肺癌患者在乏氧条件下VEGF和D114/Notch通路分子的异常表达和相互关系。方法：1.患者：共36例新诊断肺癌患者被纳入本次研究(女9例,男27例,年龄42-83岁,中位数63岁)。36份肺癌标本及27份肿瘤边缘部分的正常标本均来自中国济南山东大学齐鲁医院肺癌手术。肿瘤和正常肺组织由认证的病理医师检验,正常肺标本被证实是完全不沾染肿瘤组织的。这项研究由山东大学齐鲁医院机构审批委员会批准,在每个患者纳入这项研究之前均签署知情同意书。2.免疫组化分析：福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片在二甲苯中脱蜡、在浓度呈梯度的乙醇中再水化,并在柠檬酸缓冲液中微波加热以优化抗原恢复。非特异结合位点被稀释的山羊血清室温下作用30分钟后阻滞,载玻片同兔源初级单克隆抗体包括抗人Notchl胞内部分(ab8387)、Hesl (ab49170)、 D114 (ab7280)、VEGFR1 (ab2350)、VEGFR2 (ab2349)、HIF1 α(abl)孵育(以上单克隆抗体均来自Abeam公司),或者同VEGF (ZA-0509)和CD31(ZM-0044)孵育(以上抗体来自中国中杉有限公司),以1：200的浓度稀释,4℃过夜。磷酸缓冲盐被用于所有后续水洗和抗血清稀释。在经过充分的冲洗(3×5分钟)以去除多余的抗体后,载玻片同稀释的HRP标记的山羊抗兔抗体(中国北京晶美有限公司)在室温下孵育1小时。然后所有的载玻片经SP法(中国北京中杉有限公司)在室温下处理30分钟。无免疫性的IgG代替初级抗血清被用作阴性对照。为了每个样本的检测和积分,所有的载玻片成批量的单独染色,从而获得同等的染色。所有的图片经过数字化处理,应用Image Pro Plus(简称IPP,为一个数字化免疫组化评分程序,出自美国加州圣地亚哥Media Cybernetics公司)软件处理。3.RNA萃取和反转录：总RNA按照制造商的说明用Trizol (Invitrogen公司)分离。从每一个标本提取的1ug总RNA大约作用于合成第一链cDNA,应用ReverAidTM First Strand cDNA Synthesis试剂盒(美国MBI公司)。反转录反应在42℃进行1小时,随后95℃进行5分钟。实时定量聚合酶联反应(RQ-PCR)应用ABI Prism 7500程序检测系统(美国加州福斯特市应用生物系统公司),按照制造商的说明完成。实时PCR包括,最后20uL体积,lOuL的2倍荧光实时PCR混合液,1uL的cDNA和luL的正向和反向引物。热循环概括来说包括一个95℃变性步骤5分钟,然后在95℃40周期持续15秒,65℃持续15秒和72℃45秒。所有试验一式三份。PCR产物通过溶解曲线和琼脂糖电泳分析来确定产物大小,确认没有副产品形成。这个结果均相对于一定数量的GAPDH副本来作为一个内参照。4.人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)培养：HUVECs是按照既往文献报道的方法(Marin等,2001)从新鲜的人类脐静脉分离。简而言之,使脐静脉充满了胶原酶。然后我们在37℃将其孵育7分钟。孵育后将脐静脉轻轻的揉捏以使细胞分离。我们通过离心获得HUVECs. HUVECs培养在M199介质中,补充20%胎牛血清(来自Gibco),37℃和5%二氧化碳环境中。HUVECs被用于第3到7步的转染过程。5.D114转染HUVECs:转染是应用Lipofectamine 2000的24孔板按照厂商的说明去完成的。简而言之,在500uL的无抗生素的介质中生长的HUVECs (5×105)被播种到板子上。24小时后,8ug质粒DNA pD114-IRES2-EGFP或他的主控制载体Pires2-EGFP(由德国海德堡大学Andreas Fischer博士惠赠)在50uL的opti-MEM I Medium中同稀释的Lipofectamine 2000混合作用20分钟。然后将混合物加入板子。8小时后转染介质被移除,取而代之的是培养介质。HUVECs在转染后3天被收获,用于实时PCR检测。6.统计分析：统计分析应用SAS9.0软件完成。对于非正态分布或方差不齐的数据,显示的是中位数或范围。组间比较应用Wilcoxon秩和检验或Studentt检验分析。Spearman检验被用于相关分析。P值<0.05被认为具有显著性意义。结果：1.肺癌患者中异常表达D114/Notch和VEGF通路分子的概况：肺癌组织中的VEGFR1、VEGFR2和HES1较对照组的显著增高,同时肺癌中VEGFR1/VEGFR2比值显著降低。虽然其他分子如Notch1、D114和VEGF在肺癌中稍高,但未观察到显著统计学差异。RQ-PCR方法被用于确认Notch-IC和D114蛋白水平的交替。同免疫组化分析一致的是,肺癌组Notchl-IC和D114平均水平[2.49×10-4(4.23×10-5～2.80×10-3)或1.7×10-3(3.75×104～4.45×10-2)]稍高于对照组的水平[8.05×10-5(1.09×10-5-2.35×10-2)或7.3×10-4(1.34×10-5～5.6×10-1)]。计算了这两者之间的Spearman相关系数。在肺癌组织中VEGFR1同Notchl呈负相关(r=-0.43356, p=0.0117), VEGFR1同D114呈正相关(r=0.35809,p=0.0442)。而在肺癌组织中VEGFR2同D114呈正相关(r=0.25427,p=0.1405)。除此之外,其他指标之间不存在相关性。2.肺癌组织中HIFl α和CD31的升高：用免疫组化的方法确定CD31和HIF1α的水平,结果表明肺癌组织中的HIF1 α和CD31水平显著高于对照组的水平。在肺癌组织中,CD31同VEGFR1呈负相关(r=-0.38055, p=0.0289),同HIF1α呈正相关(r=0.35437,p=0.0340)。另外,HIF1α和HES1在肺癌组织中接近正相关(r=0.31745,p=0.0767)。在其他因素中没有发现显著性差异。3.在HUVECs中D114上调Notch的表达和下调VEGF的表达：为了确认D114/Notch和VEGF通路间的相互关系,培养中的HUVECs被表达DLL4的质粒转染。同转染了带有GFP的作为对照的质粒相比,转染了D114的HUVECs的D114、Notchl和VEGFR1是上调的,而VEGF和VEGFR2是下调的(P<0.05)。4.肺癌患者中D114/Notch和VEGF通路分子的临床相关性：VEGFR2在Ⅰ期(中位数：116.59,范围：50.512～396.853)中显著高于Ⅱ期及Ⅲ期(中位数：79.413,范围：5.078～176.993；p=0.0193)。至于分化程度,VEGF表达在低分化肺癌组织中(中位数：92.188,范围：10.248-126.330)高于高分化组织(中位数：51.266,范围：16.745～109.059；p=0.0225)。在肺癌组织中其他分子和临床参数之间没有发现显著性关系。结论：1. VEGF及Notch信号通路分子在肺癌中是过度表达的,它同乏氧(HIFla)及血管生成(CD31)呈正相关。2.肺癌关于血管生成的VEGF和D114/Notch信号通路之间可能存在一个负反馈回路。