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黄芩苷(baicalin,BA)是从唇形科植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥根茎中提取分离出来的一种黄酮类化合物,其生物活性显著,具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗病毒、免疫调节等药理作用。BA分子结构中黄酮和葡萄苷酸之间可以形成分子内氢键,导致其水溶性和脂溶性均较差,口服生物利用度仅为2.2%,从而临床应用得到一定限制。固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles,SLN)是粒径在10-1000 nm范围内的微粒给药体系,其特点包括毒性低、生物相容性好、生物可降解性,同时具有很好的靶向性,SLN用以包裹难溶性药物从而提高其体内吸收。前期课题组为了提高BA的口服生物利用度,将其载进SLN,制备了黄芩苷固体脂质纳米粒(BA SLN)。SLN可提高BA的生物利用度,改善BA的吸收,然而SLN提高BA吸收的机制尚不明确,国内外关于BA SLN口服吸收机制的研究较少。小肠吸收是药物吸收过程中关键步骤。最常用到的模型是人结肠腺癌Caco-2细胞模型。Caco-2细胞经过一段时间培养后,其形态学、标志酶表达、摄取转运及渗透特征均与小肠上皮细胞类似,所以常被用于药物经小肠上皮细胞吸收机制的研究。本课题在既往工作基础上,建立Caco-2细胞摄取和转运模型,考察BA及BA SLN在肠上皮细胞的摄取转运特性,初步阐释SLN提高BA小肠吸收的机制,以期为BA SLN的处方设计提供理论依据。目的:探究BA及BA SLN在Caco-2细胞模型中摄取特性和转运机理,初步阐明BA及BA SLN经肠上皮细胞的吸收机制。方法:建立体外Caco-2细胞摄取和转运模型,观察细胞形态,跨膜电阻值(TEER)和顶端侧(AP)与基底侧(BL)的碱性磷酸酶(ALP)的活性比值检测细胞单层的致密性和极化特征;利用CCK-8法和LDH法检测BA及BA SLN对Caco-2细胞的毒性,筛选出安全的给药浓度;建立细胞中BA的含量测定方法,并进行方法学验证;通过研究时间、浓度、温度和内吞抑制剂对BA和BA SLN的Caco-2细胞摄取量的影响探究BA和BA SLN入胞方式及摄取特性;转运实验检测出BA及BA SLN在Caco-2细胞上的表观渗透系数(Papp)和外排率(ER);激光共聚焦显微镜检测Zona occluding-1(ZO-1)的分布;采用P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白2(MRP2)和乳腺癌耐药蛋白(BCRP)蛋白抑制剂研究外排转运蛋白对BA和BA SLN的转运影响;Western blotting法检测ZO-1、P-gp、MRP2和BCRP蛋白的表达。结果:1.Caco-2细胞摄取、转运模型的建立及毒性检测Caco-2细胞培养5-7天左右,在倒置显微镜下观察,基本达到融合,边界清楚,呈铺路石状;培养至14天,形态学观察结果显示细胞均匀、致密。Caco-2细胞单层TEER随培养时间的延长而增高,17及21天时,TEER值分别为545.84Ω·cm~2、556.98Ω·cm~2;此细胞模型AP侧与BL侧的ALP活性比值随培养时间的延长而增高,培养14及21天时,其比值分别为5.05±0.09、9.10±0.25,可用于细胞转运实验。CCK-8法检测BA及BA SLN对Caco-2细胞的毒性,随着药物浓度的增加,细胞存活率有降低趋势;当BA及BA SLN浓度在0-150μg/mL时,孵育24 h后细胞存活率均与空白组没有显著差异;LDH法检测细胞膜的完整性,在0-150μg/mL浓度范围内,乳酸脱氢酶的释放率无明显变化;药物浓度达到150μg/mL以上,乳酸脱氢酶释放率明显增加。2.黄芩苷固体脂质纳米粒在Caco-2细胞模型中的摄取特性药物浓度为150μg/mL时,0-1 h内BA及BA SLN在Caco-2细胞摄取量随时间延长而增加。0-150μg/mL系列浓度的BA及BA SLN在Caco-2细胞中摄取1 h,摄取量随浓度的增加而增大,且每个浓度下,BA SLN溶液的细胞摄取量均显著高于BA溶液。药物浓度为150μg/mL时,分别于4°C和37°C下孵育1 h,BA及BA SLN在Caco-2细胞中摄取量随温度升高而明显增加。当内吞抑制剂β-环糊精和氯丙嗪存在时,BA在Caco-2细胞上的摄取量没有明显的变化,而BA SLN在Caco-2细胞上的摄取量明显减少。3.黄芩苷固体脂质纳米粒在Caco-2细胞模型中的转运机制与BA组相比,BA SLN组在Caco-2细胞单层由AP到BL的Papp显著增加,ER显著下降;BA组和BA SLN组的细胞间紧密连接蛋白ZO-1呈现连续状,且与空白组相比,BA组和BA SLN组的ZO-1蛋白的表达无显著差异;MRP2蛋白抑制剂MK-571和BCRP蛋白抑制剂KO-143可降低BA的外排率,而BA SLN则不受外排蛋白抑制剂的影响;与空白组相比,BA对外排蛋白MRP2和BCRP的表达无显著影响,BA SLN则显著降低外排蛋白MRP2和BCRP蛋白的表达。结论:1、Caco-2细胞摄取和转运模型建立成功;BA及BA SLN作用于细胞的安全浓度范围为0-150μg/mL。2、BA在Caco-2细胞上的摄取方式为被动扩散和主动转运;BA SLN在Caco-2细胞上的摄取存在着被动扩散和主动转运,且受内吞抑制剂影响,BA SLN可通过内吞的方式入胞,从而增加BA摄取量。3、BA SLN显著增加了BA的跨膜转运能力,BA SLN无法打开细胞间的紧密连接,其增加药物跨膜转运的能力与细胞旁路途径无关。BA易受到外排蛋白MRP2和BCRP的作用被细胞外排导致吸收较差,将BA载入SLN后,BA SLN可避开了此类外排蛋白的外排作用,从而减少药物的外排。