巨大芽孢杆菌拮抗白绢病的选育及机制研究

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白绢病是一种严重的土传病害,可侵染500多种植物,因此本文利用常压室温等离子体(ARTP)技术对巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium L2进行诱变处理,通过平板初筛、摇瓶复筛和遗传稳定性来筛选对白绢病原菌Sclerotium rolfsii R-67拮抗效果较强的正突变株,通过广谱抑菌性、磷代谢能力、环境耐受性、产苯乙酸能力来探明巨大芽孢杆菌诱变前后抑菌特性差异,同时初步探究从巨大芽孢杆菌中分离出的单体化合物——苯乙酸对R-67的抑菌机理。结果如下所示:1、经平板初筛、液体摇瓶复筛和遗传稳定性考察,从420株L2突变株中筛选得到3株对R-67抑制效果较强且遗传稳定的正突变株,即30s-56、40s-22、60s-60,对R-67的抑制能力较出发菌株分别提高了45.49%、56.70%、45.99%。2、广谱抑菌性实验结果显示:以出发菌株为对照,正突变株30s-56对烟草疫霉病原菌PN1201的抑菌能力提高了9.20%;正突变株40s-22对白绢病原菌R-67的抑菌能力提高了31.80%,对烟草青枯病原菌Q11-2提高了7.90%;正突变株60s-60对赤星病原菌A-3、魔芋软腐病原菌EC-1的抑菌能力分别提高了85.06%、46.36%;但各菌株对根癌农杆菌T-37、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌三种病原细菌均无抑制作用。3、磷代谢实验结果显示:10 h时正突变株30s-36、40s-22、60s-60的磷代谢能力相当,虽强于出发菌株,但差异不显著(p>0.05),可见诱变前后巨大芽孢杆菌对磷的代谢能力基本一致,ARTP诱变没有对磷代谢产生太大影响。4、通过对环境因素考察发现,当温度超过35°C、p H超过7、Na Cl浓度超过1%时,出发菌株与正突变株30s-36、40s-22、60s-60的抑菌率生物量开始下降;在重金属Ba+的环境中具有较高生物量和抑菌率,在重金属Ag+的环境中,各菌株生物量和抑菌能力较低,在重金属Pb+、Cu+、Zn+环境中各菌株均不能生长。正突变株在不同环境中对R-67的抑菌能力均表现出了强于出发菌株。5、产苯乙酸能力测定结果显示:出发菌株培养物中苯乙酸含量为200.25±1.66 ng/m L,正突变株30s-36、40s-22、60s-60分别为203.51±1.73 ng/m L、430.50±2.81 ng/m L、623.47±1.81 ng/m L,各突变株产苯乙酸的能力都较出发菌株有所提高,其中40s-22、60s-60分别较出发菌株提高了114.98%、211.35%。6、巨大芽孢杆菌单体化合物苯乙酸对R-67的抑菌机理结果显示:苯乙酸对R-67的EC50为0.475 mg/m L;苯乙酸处理R-67 5 d后发现菌落直径变小、边缘不规则、菌丝较空白对照疏松,处理15 d后结核数量变少,仅为空白对照的25.96%(p<0.05);苯乙酸作用R-67后胞外电解质及可溶性糖含量增高,菌丝出现褶皱、畸形、溶解、原生质凝结、顶端膨大等现象,并且菌体内丙二醛及ROS含量升高,推测苯乙酸可激发R-67产生过量氧自由基引发膜脂过氧化反应,破坏细胞膜完整性,使胞内电解质及大分子糖类物质外泄,导致细胞死亡;此外发现R-67菌体内可溶性蛋白及三羧酸循环关键酶(SDH、MDH)含量降低,推测苯乙酸还可以影响R-67蛋白合成及能量代谢发挥抑菌作用。
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