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研究背景: 长期以来，脓毒症发病率一直呈现逐年增长的趋势。脓毒症病情进展迅速、临床救治困难，我国脓毒症患者的死亡率居高不下，大约为20％～40％，死亡率接近于急性心肌梗死，是导致危重患者死亡的重要原因之一。脓毒症患者死亡的主要原因之一是心肌损伤，伴有严重心功能障碍时患者病死率升高50%。已有报道指出，机体发生脓毒症时，阿片δ受体激动剂脓毒症中单一脏器有显著的保护作用，能明显提高大鼠的生存率。早期对脑啡肽心肌保护的研究结果提示脑啡肽心肌保护与自噬通路PI3K/AKT/mTOR可能存在一定联系，需要进一步深入证实，以利于DADLE的脓毒症心肌保护作用机制并为临床指导脓毒症心肌损伤的治疗提供一定的实验基础。 线粒体自噬是在应激状态下，细胞通过自噬的方式特异性地消化分解线粒体的过程。在机体中，心脏作为氧化代谢率最高的组织，成年心肌细胞40%的体积为线粒体。线粒体功能降低和结构损伤是脓毒症心肌损伤的关键特征之一。在脓毒症心肌损伤中，线粒体自噬呈双向调节作用，既有增强自噬引起的心肌保护作用，又有过度自噬诱发的心肌损伤。但是，DADLE对脓毒症心肌损伤的保护作用是否通过调节线粒体自噬尚未见任何报道。 实验目的： 观察阿片δ受体激动剂DADLE（[D-Ala2，D-Leu5]-enkephalin）对脓毒症小鼠心肌的保护作用及生存率的影响，并探讨其与线粒体自噬的关系。 实验方法： 1. DADLE对内毒素血症小鼠生存率的影响 选取健康雄性C57BL/6J小鼠120只（8-10周，20-25g），随机分为4组（n=30）， A组、B组、C组、D组；先用生理盐水溶解LPS粉末使其浓度为1mg/ml，然后以致死剂量（18mg/kg）对各实验组小鼠进行腹腔注射。A组：注射LPS后立即于对侧腹腔注射DADLE5mg/kg(浓度为1mg/ml)，B组：注射LPS后立即于对侧腹腔注射等量生理盐水，C组：注射LPS4h后于对侧腹腔注射DADLE5mg/kg(浓度为1mg/ml)，D组：注射LPS4h后于对侧腹腔注射等量生理盐水，每6h观察并记录各组小鼠1周内的生存状况，用Kaplan-Meier法统计小鼠存活时间，计算各时间点生存率。 2.脓毒症时心肌自噬水平的变化 另取40只同批次C57BL/6J雄性小鼠（8-10周，20-25g），随机分组法将其分为5组（n=8）。空白对照组,LPS6h组，LPS12h组，LPS24h组，LPS36h组，LPS各组分别腹腔注射LPS10mg/kg(浓度为1mg/ml),空白对照组注射等量生理盐水。分别于相应时间点处死小鼠，JC-1染色测定线粒体膜电位(MMP)变化，Western Blot检测细胞及线粒体自噬体标志性蛋白 LC3-II/GAPDH、PINK1/Parkin表达水平。3. DADLE对心肌自噬水平的研究 再取50只8-10周龄，20-25g的同批次C57BL/6J雄性小鼠，按照随机分组法随机将其分为5组，每组十只（n=10）。空白对照组：腹腔注射生理盐水；LPS组：两侧腹腔分别注射LPS10mg/kg(浓度为1mg/ml)及生理盐水，DADLE组：两侧腹腔分别注射10mg/kgLPS及5mg/kgDADLE(超纯水稀释DADLE使其注射浓度为1mg/ml)，Naltrindole组：腹腔注射LPS后立即于对侧腹腔注射Naltrindole5mg/kg(浓度为1mg/ml)， Naltrindole+DADLE组：腹腔注射LPS后立即于对侧腹腔注射Naltrindole5mg/kg(浓度为2mg/ml)，30min后注射DADLE5mg/kg(浓度为2mg/ml)。分别于注射LPS6h、12h后处死小鼠，每组各5只，留取血清测定cTnI水平，利用透射电镜观察心肌结构及自噬体形成，JC-1染色测定线粒体膜电位(MMP)变化，Western Blot检测细胞及线粒体自噬体标志性蛋白 LC3-II/GAPDH、PINK1/Parkin表达水平。 实验结果： 1. LPS建模7d后，普通生理盐水组（注射LPS后立即注射）30只小鼠存活3只，生存率为10%，而DADLE干预组（注射LPS后立即注射）30只小鼠7d后存活10只，生存率为33.3%，两组生存率比较有显著性差异（P<0.05）。LPS建模7d后，普通生理盐水组（注射LPS后4h注射）30只小鼠存活4只，生存率为13.3%，而DADLE干预组（注射LPS后4h注射）30只小鼠7d后存活10只，生存率为33.3%，两组生存率比较有显著性差异（P<0.05）。结果提示：把致死剂量的LPS(18 mg/kg)给小鼠注射后立刻或4h后给予DADLE能显著改善脓毒症小鼠的生存率。 2.以空白对照组的MMP数值作为参照1，LPS6h组，LPS12h组，LPS24h组的MMP数值分别为0.435，0.673，0.784，较空白对照组明显降低（P<0.05），LPS36h组的MMP为0.921，与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。LPS各组中LPS6h组的MMP最低，与LPS12h组，LPS24h组，LPS36h组比较差异有统计学意义（P<0.05）。研究结果显示：与对照组相比，LPS注射6h引起的时线粒体膜电位降低最为显著，但随着时间延长，膜电位逐步回升，注射后36h时基本恢复到基线水平；细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/GAPDH在腹腔注射LPS12h明显升高，然后逐渐下降；PINK1/parkin在腹腔注射LPS6h明显升高，然后逐渐下降。 3.空白对照组血清cTnI水平为0.1550ng/ml，LPS12h组为0.8288ng/ml，较空白对照组明显升高（ P<0.05）；DADLE处理组血清cTnI水平为0.6258ng/ml，较LPS12h组下降24.5%（P<0.05）。LPS6h组的MMP数值为0.435，DADLE处理组的MMP数值为0.683，较LPS6h组升高36.3%（P<0.05）。透射电镜观察心肌超微结构发现：DADLE处理组的心肌肌节及线粒体结构较LPS组规则整齐，线粒体空泡化减轻。透射电镜下观察心肌细胞自噬体数量结果显示：LPS组的自噬体数量为10个，DADLE处理组的自噬体数量为16个，较LPS组增加60%（P<0.05）。Western blot结果显示：DADLE处理组的细胞及线粒体自噬体标志性蛋白 LC3-II/GAPDH、PINK1/Parkin表达水平明显增加，与LPS组比较 P<0.05。阿片δ受体拮抗剂Naltrindole可抵消其保护效应，且单独应用Naltrindole心肌损伤更加严重。 结论： 1. DADLE可提高脓毒症小鼠的生存率。 2.脓毒症心肌损伤时心肌细胞及线粒体自噬水平升高，自噬应激可能更早发生于心肌线粒体。 3. DADLE保护心肌，减轻LPS诱导的cTnI升高及MMP下降。 4. DADLE对LPS小鼠心肌的保护作用与细胞及线粒体自噬增强有关。