胆南星（Arisaema cum Bile）是有毒中药天南星的常用炮制品之一,为制天南星的细粉与牛、羊或猪胆汁经加工而成,或为生天南星细粉与牛、羊或猪胆汁经发酵加工而成。具有清热化痰、息风定惊之功,临床常用于治疗中风痰迷、癫狂惊痫等症。《本草汇言》有云:“如小儿惊风惊痰,四肢搐搦,……非胆星不能疗也”。现代临床文献亦显示胆南星常用于治疗小儿热性惊厥。牛黄抱龙丸、七珍丸、牛黄镇惊丸等含有胆南星的中成药广泛用于治疗小儿急惊风、高热抽搐等儿科疾病。热性惊厥（Febrile Seizures）是儿科常见疾病,现代研究认为该病发生与免疫炎症过程密切相关,炎症因子大量释放可引起机体发热,进而引起下丘脑及海马等脑区神经元兴奋,形成异常放电导致热性惊厥。长时间反复发作的热性惊厥可引起海马神经元细胞损伤诱发脑内炎症反应,进一步导致惊厥发作、神经元细胞损伤等。文献研究显示胆南星具有抗炎、镇静等药理作用,课题组前期研究亦发现胆南星具有显著的抗惊厥作用,然而胆南星抗热性惊厥效应物质基础仍不明确,胆南星效应相关的质量标志物不明。基于文献研究及课题组前期研究基础,本论文通过构建热性惊厥小鼠模型,考察胆南星的药效作用,并构建脂多糖（LPS）诱导小鼠脑BV-2小胶质细胞炎症模型,筛选胆南星水提物效应部位,并开展药效物质基础研究,为胆南星抗热性惊厥效应物质基础研究提供科学依据。具体研究内容如下:1.胆南星水提物对热性惊厥模型小鼠效应作用研究本研究首次采用皮下注射20%干酵母混悬液再以60mg·kg-1戊四氮溶液为致惊剂构建热性惊厥模型。以体温计测定小鼠肛温,图像采集记录小鼠惊厥潜伏期及惊厥持续时间,苏木精-伊红（HE）组织染色评估海马神经元损伤病理表现,ELISA法检测血清PGE2、cAMP含量,蛋白免疫印迹（Western-blot）法检测小鼠脑组织COX-2、iNOS、GFAP、GABAAR蛋白表达水平,实时荧光定量PCR（RT-PCR）法检测海马组织IL-6、IL-1β、TNF-α炎症因子mRNA表达水平为指标。结果表明,与空白组比较,模型组小鼠肛温显著上升,同时发生惊厥反应。与模型组比较,胆南星水提物能有效延长惊厥潜伏期,缩短惊厥持续时间,上调脑组织A型GABA受体（GABAAR）蛋白的表达,同时降低模型小鼠肛温,降低血清cAMP、PGE2水平,表明胆南星具有解热、抗惊厥的作用;与空白组相比,模型组小鼠的海马区组织形态整体结构异常,海马区神经元数量异常,锥体细胞形态异常,可见神经元细胞核固缩深染,排列不规整,表明长时间的惊厥发作破坏了神经元细胞的正常形态结构,但胆南星组海马神经元形态未见明显变化,表示胆南星能够保护海马区神经元免受损伤;同时,脑内星形胶质细胞中胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达下调,显示胆南星具有抑制星型胶质细胞激活的作用,而星型胶质细胞激活与脑损伤存在一定相关性,表明胆南星发挥抗惊厥作用可能与抑制星型胶质细胞激活有关。胆南星能够下调一氧化氮合酶（iNOS）、环氧合酶-2（COX-2）蛋白的表达,同时下调海马组织IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子mRNA表达水平,表明胆南星在发挥抗热性惊厥药效的同时抑制了脑内炎症反应的发生。由于脑内炎症反应的发生可提高惊厥发作易感性,胆南星拮抗热性惊厥的作用一定程度可能与其抑制脑内炎症反应相关。上述研究表明,胆南星具有显著的抗热性惊厥、保护海马神经元免受损伤,抑制脑内炎症发生的作用。2.胆南星水提物对LPS诱导的小鼠脑BV-2小胶质细胞炎症模型的效应作用研究通过构建LPS诱导的小鼠脑BV-2小胶质细胞炎症模型探讨胆南星水提物抗热性惊厥效应物质基础,以Griess法测定细胞培养基上清液中一氧化氮（NO）含量及RT-PCR法测定IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子mRNA表达水平为指标评价效应作用。结果表明,与空白组比较,模型组NO含量,IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子mRNA表达水平显著升高,说明造模成功;与模型组比较,胆南星组NO含量,IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子mRNA表达水平显著降低,说明胆南星水提物显著抑制LPS诱导的BV-2小胶质细胞释放NO,降低IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子mRNA表达水平,进一步说明胆南星具有抑制脑内炎症发生的作用。同时该模型用于后续的效应物质筛选。3.胆南星水提物效应部位筛选研究为进一步研究胆南星水提物效应部位,通过LPS诱导BV-2小胶质细胞炎症模型,以Griess法测定细胞培养基上清液中NO含量及RT-PCR法测定IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子mRNA表达水平为指标评价效应作用,筛选胆南星水提物抗热性惊厥效应部位。结果表明,与模型组比较,胆南星水提物醇沉上清部位组能显著降低NO含量,IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子mRNA表达水平,而醇沉沉淀部位无明显效应。将胆南星水提物醇沉上清部位通过系统溶剂萃取法进一步分离筛选效应部位。结果表明,与模型组比较,胆南星水提物乙酸乙酯部位及正丁醇部位显著降低NO含量,IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子mRNA表达水平,而石油醚部位及水部位无明显效应。说明乙酸乙酯部位及正丁醇部位是胆南星水提物抑制脑内免疫细胞炎症反应的主要效应部位,且乙酸乙酯部位效应强于正丁醇部位。4.通过UPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析胆南星效应部位成分组成通过UPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析胆南星乙酸乙酯部位、正丁醇部位成分组成,并根据碎片裂解规律对未知成分进行推断。建立胆南星成分数据库,通过与数据库比对分析,从胆南星水提物乙酸乙酯部位总共鉴定成分61个,主要包括有机酸类18个,胆汁酸类17个;从胆南星水提物正丁醇部位总共鉴定成分72个,主要包括胆汁酸类23个,有机酸11个。胆汁酸类成分主要为鹅去氧胆酸（CDCA）、猪去氧胆酸（HDCA）等成分;有机酸类成分主要为棕榈酸、亚麻酸、硬脂酸等成分。正丁醇部位和乙酸乙酯部位共有的成分主要为鹅去氧胆酸（CDCA）、猪去氧胆酸（HDCA）、猪胆酸（HCA）、亚油酸、硬脂酸、棕榈酸等34个成分。5.胆南星水提物效应部位中胆汁酸类成分含量测定及效应验证采用HPLC-ELSD法对乙酸乙酯部位、正丁醇部位胆汁酸类成分含量进行研究,方法学考察结果显示,符合含量测定要求。含量测定结果表明,乙酸乙酯部位中主要的胆汁酸类成分猪去氧胆酸（HDCA）、鹅去氧胆酸（CDCA）平均含量分别为17.99%,6.68%。正丁醇部位未能检测到胆汁酸类成分,与前述质谱分析结果有差异,推测正丁醇部位中胆汁酸类成分含量低于液相色谱检测限。采用体外LPS诱导小鼠脑BV-2小胶质细胞炎症模型评价乙酸乙酯部位、胆汁酸类成分（HDCA、CDCA）组合物的药效差异,结果显示,与模型组比较,乙酸乙酯部位及胆汁酸类成分组合物均显著降低NO含量,IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子mRNA表达水平,但胆汁酸类成分组合物的作用不及乙酸乙酯效应部位,说明除HDCA、CDCA外还有其他成分发挥药效作用,如质谱分析获得的有机酸类等成分也可能是胆南星的效应成分。从目前研究可见,胆南星中胆汁酸类成分的种类清晰、具有较强的专属性,成分含量较高,建议将鹅去氧胆酸、猪去氧胆酸作为胆南星效应相关的质量标志物。总结本论文研究发现胆南星水提物能够降低热性惊厥模型小鼠肛温,延长惊厥潜伏期,缩短惊厥持续时间,上调GABAAR蛋白表达;同时降低血清cAMP、PGE2水平,改善海马神经元细胞形态学变化,下调脑组织COX-2、iNOS、GFAP蛋白表达,降低海马组织IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子mRNA表达水平,说明胆南星具有良好的抗热性惊厥药效作用,其机制可能与解热、拮抗脑组织炎症有关。.胆南星水提物醇沉的上清液具有抑制小鼠脑BV-2小胶质细胞炎症反应的作用,醇沉上清液的乙酸乙酯部位及正丁醇部位为胆南星抗热性惊厥的效应部位,且乙酸乙酯部位强于正丁醇部位。UPLC-Q-TOF-MS/MS分析显示效应部位中主要含胆汁酸类成分、有机酸类成分;其中乙酸乙酯部位鉴定成分共有61个,有机酸类成分18个、胆汁酸类成分17个;正丁醇部位鉴定成分共有72个,胆汁酸类成分23个、有机酸类成分11个。体外实验显示,效应部位中含量较高的两种胆汁酸类成分组合物具有显著的抗炎作用,胆汁酸类成分是胆南星抗热性惊厥的主要效应成分类别之一。胆南星中胆汁酸类成分类别清晰、具有较强的专属性,成分含量较高,建议将猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸作为胆南星效应相关的质量标志物。本文研究将为胆南星质量控制及临床应用提供依据。