论文部分内容阅读
研究背景:子痫前期是妊娠期特发疾患,病因复杂,病情严重,是困扰妇产界的一道难题。后代发育受累是子痫前期的重大危害之一。研究表明,子痫前期患者的后代出现宫内发育受限、低/高出生体重、早产等不良事件的机率明显高于正常孕妇后代,严重影响了早期生存质量。尽管如此,除了母体病变、胎盘功能障碍、提早娩出等可能的间接因素外,子痫前期患者后代健康受损的具体机制并不明确。1999年,Wallukat等首次报道,在子痫前期患者体内存在抗血管紧张素II 1型受体的自身抗体(Angiotensin II type 1 Receptor Autoantibodies,AT1-AA),该抗体特异性识别AT1受体的细胞外第二环功能表位肽段(AT1R-ECII),具有AT1受体类激动剂样效应,可诱发平滑肌细胞表达组织因子,滋养层细胞生成NADPH氧化酶,血管收缩等多种病理现象。现有研究表明,AT1-AA为IgG类免疫球蛋白,而IgG类免疫球蛋白的部分亚类可以由母体被动转运至后代体内,因此我们推测,母体内的AT1-AA可能会转给后代,进而影响其生长发育。为了验证此假说,本研究利用主动免疫母鼠模型,拟解决以下问题:1)明确母体中的AT1-AA是否具备被动转运能力;2)抗体的被动转运有胎盘和乳汁两条途径,观察AT1-AA的被动转运是通过胎盘和/或乳汁;3)分析母体内AT1-AA属于何种抗体亚类;4)检验母体中的AT1-AA转运至后代体内后是否仍有活性。以上四个问题的回答将是我们进一步探讨AT1-AA影响后代生长发育的可能机制,以及指导临床正确进行母婴保健的重要前提。目的:1.明确母鼠体内AT1-AA的被动转运能力及转运途径;2.鉴定母鼠体内AT1-AA的抗体类及亚类;3.检测新生后代鼠体内AT1-AA的活性。方法:选取未曾受孕的雌性Wistar大鼠(8周龄,180-200g)和健康雄性Wistar大鼠(220-250g),将雌鼠分为免疫组和对照组。商业合成人AT1R-ECII肽段(165-191,I-H-R-N-V-F-F-I-E-N-T-N-I-T-V-C-A-F- H-Y-E-S-Q-N-S-T,纯度为95%,吉尔生化),以此为抗原主动免疫免疫组雌鼠,2周一次,使其产生AT1-AA。待免疫雌鼠体内抗体浓度达高峰后,将其与正常雄鼠(未免疫)交配,以发现阴栓为怀孕第0天。雌鼠合笼后,每4周加强免疫一次。对照组雌鼠只给予相应的抗原佐剂,其余同免疫组。(1)两组母鼠正常分娩后,于哺乳1周时检测各自的后代鼠体内有无AT1-AA;(2)同样的免疫孕鼠模型,孕20天时,孕鼠行剖宫术,留取胎鼠血清并固定胎盘,ELISA及免疫组化法检测其中有无AT1-AA。(3)在哺乳期,由乳鼠胃内收集母鼠乳汁,ELISA法检测其中AT1-AA的分布,并对调同日内生产的免疫组和对照组雌性(或雄性)乳鼠,同胎的雄性(或雌性)乳鼠正常哺乳作为参照,比较各组乳鼠血清中AT1-AA的含量。(4)ELISA法鉴定AT1-AA的免疫球蛋白类及亚类。(5)亲和柱提纯哺乳1周时后代鼠体内的总IgGs,利用离体灌流技术和大/微血管环技术,观察抗体对离体心脏和血管功能活动的影响及作用途径。(6)根据试剂盒说明,检测哺乳1周时两组乳鼠血清中内皮素-1(Endothelin-1,ET-1)的含量。结果:1. AT1-AA阳性的免疫雌鼠模型建立为了研究AT1-AA的被动转运特点,本研究采用主动免疫法建立AT1-AA阳性的孕鼠模型。ELISA检测显示,待孕的雌性Wistar大鼠于初次免疫后2周,血清中已有AT1-AA出现,并且滴度迅速升高,在8周时达高峰(OD值为2.76±0.07 vs. 0.43±0.05,P < 0.01, vs.同期对照组,图1a),同期对照组则无AT1-AA产生。而且,免疫鼠生成的AT1-AA属于IgG类免疫球蛋白(图1a)而非IgM类及IgA类(图1b,1c),同患者体内的抗体一致,表明主动免疫成功。2.母鼠中的AT1-AA可被动转运给后代为了首先明确免疫母鼠体内的AT1-AA能否转运给胎儿,ELISA法检测了哺乳1周时两组后代鼠体内的抗体。结果发现,AT1-AA阳性的免疫组母鼠所产后代,于检测时血清中该抗体显著阳性(n=8),P/N值大于2.1(OD值为1.49±0.25),而对照组胎鼠血清中则无该抗体(n=9),P/N值小于1.5(OD值为0.13±0.03),两者相比P < 0.01(图2)。3. AT1-AA可通过大鼠胎盘为了单独观察AT1-AA的胎盘转运途径,利用同样的动物模型,ELISA法检测临产时(孕20天)胎鼠血清,发现AT1-AA阳性的免疫组孕鼠,其宫内胎鼠血清中AT1-AA的含量(n=12,OD值为2.32±0.35)显著高于对照组胎鼠(n=12,OD值为0.13±0.04),两者相比P < 0.01(图3a)。为了直接追踪AT1-AA在胎盘中的转运路线,本研究又采用免疫组织化学法对两组胎盘进行染色,结果显示,在免疫鼠胎盘绒毛的滋养层细胞及血管内皮细胞处均有明显黄染(图3b),证明有AT1-AA表达,而阴性对照组胎盘中却无特异性AT1-AA存在(图3b)。4.乳汁是AT1-AA被动转运的另一重要途径哺乳1周时,由免疫组乳鼠胃内得到的母鼠乳汁,其AT1-AA水平(n=10,OD值为1.33±0.26)明显高于阴性对照组(n=10,OD值为0.19±0.10),,计算得P/N值大于2.1,即AT1-AA为阳性(图4a)。为排除乳鼠胃内的乳汁受多种因素干扰,本研究又设计了交叉喂养实验。ELISA检测显示,7天时,由免疫组母鼠代喂的对照组雌性乳鼠体内出现了AT1-AA(OD值为2.60±0.0.12 vs. 0.16±0.07,P < 0.01,vs.对照组雄性乳鼠,图4b),而由对照组母鼠代喂的免疫组雌性乳鼠体内AT1-AA水平比其同胎雄性后代的明显下降(OD值为1.04±0.26 vs. 2.62±0.08,P < 0.15,vs.免疫组雄性乳鼠,图4b)。5.免役鼠中AT1-AA的IgG亚类鉴定亲和柱纯化免疫大鼠抗血清后,得到以AT1-AA为主要成分的总IgGs,SDS-PAGE纯度检测显示,在55KDa和25KDa附近出现清晰的两条带,分别代表IgG的重链和轻链(图5a)。然后,ELISA法对该纯化抗体的IgG亚类鉴定结果证明,免疫鼠中的AT1-AA主要属于IgG2b,仅小部分属于IgG2a(图5b)。6.后代鼠中的IgGs增强离体大鼠心脏功能免疫组乳鼠血清中的IgGs(0.1μmol/L)可引起离体灌流的大鼠左室发展压(LVDP),左室压最大上升速率(+dp/dtmax)及左室压最大下降速率(-dp/dtmax)明显升高,与空白对照组相比,均具有显著性差异(P < 0.05,P < 0.01,P < 0.05)。该效应与AT1受体的激动剂angiotensin II相类似,且此两者的作用均可被AT1受体阻断剂losartan明显阻断,而即便1μmol/L的免疫对照组IgGs对离体心功能也没有影响(表1)。7.后代鼠中的IgGs引起离体大鼠胸主动脉环收缩同Table 1结果相一致,0.1μmol/L免疫组乳鼠血清中的IgGs和angiotensin II均可引起大鼠主动脉血管环明显收缩(收缩幅度分别为0.44±0.05g,0.52±0.07g),与空白对照组有显著性差异(P < 0.01)。1μmol/L的losartan可有效阻断抗体效应(0.05±0.02g,P < 0.01,vs.免疫组IgGs),而免疫对照组IgGs则对离体血管环几乎无影响(图6)。8.后代鼠体内ET-1含量升高ET-1是反映内皮损伤的重要指标之一。血清检测发现,哺乳1周时,AT1-AA阳性的免疫组乳鼠体内ET-1含量明显升高,与对照组相比差异有显著性(P < 0.05)(图7)。结论:1.免疫母鼠体内的AT1-AA具备被动转运能力;2.免疫母鼠体内的AT1-AA存在胎盘和乳汁两条转运途径;3.免疫母鼠体内的AT1-AA属于IgG2a和IgG2b亚类,在理论上再次验证了AT1-AA的被动转运性质;4.后代鼠体内的AT1-AA具有同母体内抗体相一致的功能活性。