随着人类免疫缺陷病毒（HIV）在全球蔓延，HIV感染已成为严重危害人类健康的疾病。高效抗逆转录病毒疗法能够显著地改善AIDS患者的症状，但需要终身用药，药物带来累积性毒性，一旦药物治疗失败就会产生耐药性病毒株。另一方面，现今还未找到一个完全有效的疫苗。随着对控制HIV机制的了解，很多研究者开始将注意力集中在基因治疗，将它作为单独的或者是辅助的治疗方式。RNA干扰技术通过靶向于结构蛋白或者是调节蛋白，已经有效地应用于HIV的基因治疗。由于siRNA在体内不稳定，很快就被降解，体外合成和质粒介导的RNA干扰持续时间较短，不适用于长期抑制基因表达。通过慢病毒载体表达编码siRNA的shRNA在转录水平下调HIV病毒基因从而抑制病毒复制成为基因治疗HIV一种重要的方式。将抗病毒基因导入到干细胞的方式对基因治疗达到长期治疗效果提供了希望。在筛选出针对HIV-1的tat、vpr和rev特异性siRNA的基础上，本研究分别构建了含有相应shRNA序列的重组慢病毒表达质粒，并对靶向基因的干扰效果进行了检测。在此基础上，在293T细胞中包装出含有相应shRNA序列的重组慢病毒并测定病毒滴度。将得到的重组慢病毒感染MT-4细胞，通过嘌呤霉素抗性筛选得到稳定表达siRNA的MT-4细胞系，进行HIV-1NL4-3毒株体外攻击试验，通过检测培养上清中的P24蛋白含量来比较siRNA体外抑制病毒效果。结果表明，靶向于vpr的shRNA可以在转录水平上有效地抑制vpr的表达，抑制率达到88.8%；靶向于tat的shRNA抑制率达到60.2%；稳定表达vprshRNA或tatshRNA的MT-4细胞系能够有效地抑制HIV的复制，短期内培养基中没有HIV的大量复制。基于HARRT治疗的经验，将多个抗HIV基因联合应用同样可能起到更好的抗病毒效果，因此本研究还构建了同时含有靶向于vpr和tat基因的双shRNA的重组慢病毒表达质粒，分别由人U6启动子和H1启动子控制表达；体外与含有vpr及tat基因的质粒共转染表明该重组表达质粒对vpr和tat基因在转录水平上的干扰效果分别达到89.2%和62.0%；将重组慢病毒质粒与病毒包装质粒pNL4-3共转染后，P24定量检测结果显示对HIV病毒包装的抑制率可以达到99.05%，比单独表达靶向于vpr的shRNA或靶向tat的shRNA的抑制率都要高；包装出重组慢病毒后感染MT-4细胞，同样筛选稳定表达siRNA的MT-4细胞系，HIVNL4-3病毒攻击实验表明该细胞系可以有效地抑制病毒的复制。此外，本研究还构建了同时含有基因改造的人源的Trim5a(R332P)和靶向于vpr基因的shRNA的重组慢病毒双表达质粒，分别由巨细胞病毒CMV启动子和U6启动子控制表达，两种抗HIV基因在HIV生命周期的不同阶段通过不同的机制去抑制病毒复制；共转染实验表明重组慢病毒表达质粒表达的vprshRNA可以在转录水平有效地抑制vpr基因的表达，可以达到84.05%，对HIV病毒包装的抑制率可以达到98.45%；Western blot结果表明改造的人源Trim5a(R332P)可以在细胞内表达，在TZM-BL细胞水平通过检测Luciferase表达水平表明人源的Trim5a(R332P)对HIV假病毒的抑制率可以达到63.30%；HIV NL4-3病毒攻击导入该重组慢病毒的阳性MT4细胞实验表明该阳性细胞系可以有效地抑制病毒的复制，证明含有Trim5a(R332P)和vprshRNA表达元件的联合应用具有明显地抗HIV病毒效果。含有siRNA的微粒子是通过细胞胞吐的方式将细胞内表达的siRNA包裹着细胞膜分泌到细胞外。细胞膜成分不仅可以提高siRNA的体外稳定性，而且由于生物膜成分的相似性可提高siRNA导入靶细胞的效率。为降低其免疫原性和提高亲和性，本研究选用低免疫原性的脐带间充质干细胞作为微粒子的制备宿主细胞。首先，通过重组慢病毒感染的方式将人端粒酶催化亚基（hTERT）导入细胞，提高间充质干细胞的分化增殖能力，并对传代后细胞的干细胞性进行检测。其次，导入含有靶向HIV-1的shRNA的重组慢病毒建立了能够持续产生细胞微粒子的间充质干细胞系。结果表明，筛选到的阳性hucMSCs克隆在基因组DNA和mRNA水平检测了hTERT基因的表达水平；该细胞系在体外已经持续培养105代，远远超过人脐带间充质干细胞的分裂增值界限；TRAP-PCR证实该细胞系恢复了端粒酶活性；流式细胞仪结果显示建立的hucMSCs-htert细胞表面有人间充质干细胞特异性表面标记，如CD29，CD44和CD105，不表达CD106、CD45、CD19和HLA-DR；hucMSCs-htert细胞在刺激成骨培养基中培养后，碱性磷酸酶染色表明细胞能够向成骨细胞进行分化，证明该细胞系仍然保持体外分化的潜能；核型分析表明该细胞具有46XY二倍体核型，在SCID小鼠体内不能形成肿瘤，表明该细胞还没有致瘤倾向，是安全的。并对细胞微粒子的制备、对靶向基因的抑制效果进行了初步研究，该细胞微粒可以用于HIV的基因治疗。综上所述，本研究采用慢病毒介导靶向于HIV-1调控基因的单个shRNA、双shRNA、经基因改造过的Trim5a(R332P)和vprshRNA组合的重组慢病毒载体，并且检测了它们对HIV的抑制效果。抗HIV重组慢病毒载体可以有效地感染人脐带造血干细胞，两种shRNA共同应用及不同抗HIV基因的联合应用为HIV的基因治疗提供了新的策略。另外成功地建立了永生化的人脐带间充质干细胞系，证明了外源表达人端粒酶催化亚基可以重构端粒酶的活性并能够增强细胞的增值活性；该细胞系维持了细胞的形态、细胞表面抗原和正常的二倍体细胞核型，在继代培养中仍保持了分化潜能，在SCID小鼠体内没有形成肿瘤，该细胞系为基因治疗、细胞治疗和组织工程提供了充足的细胞来源。该细胞系免疫原性非常低，被应用于制备含有靶向于HIV-1基因的成熟的siRNA的生物纳米微粒子，作为新型的HIV的基因治疗的一种方式。