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抗磷脂综合征（Antiphosphlipid syndrome,APS）是以血栓形成、病理妊娠与血小板减少为主要临床症状的非特异性自身免疫性疾病,其主要血清学特征为抗磷脂抗体（Antiphospholopid antibodies,aPL）持续阳性。以病理妊娠为主、无血栓病史的 APS 是产科 APS（Obstetric antiphospholipid syndrome,OAPS）。目前低分子肝素（Low molecular weight heparin,LMWH）与小剂量阿司匹林（Low dose aspirin,LDA）是治疗OAPS的主要方法,虽能提高患者活产率,但仍有30%的患者出现严重并发症,妊娠早期易诱发复发性流产（Recurrent spontaneous abortion,RSA）。因此,寻求难治性OAPS患者有效治疗方案与探究OAPS并发RSA的分子机制迫在眉睫。本研究通过阐述OAPS相关RSA的分子机制,探索羟氯喹（Hydroxychloroquine,HCQ）治疗难治性OAPS相关RSA的保护机制,揭示HCQ治疗难治性OAPS的临床疗效与药物安全性,为HCQ在临床中应用提供一定的理论依据。实验方法1.收集21名难治性OAPS患者完整临床资料,对这些患者在抗凝治疗基础上联合HCQ进行治疗,采用t检验或χ2检验评估HCQ的临床疗效及其药物安全性,单因素分析与流产发生的相关因素。2.采用NabTM Protein A Plus Spin试剂盒提取血清中IgG,BCA试剂盒测定IgG浓度。3.提取人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）)与蜕膜组织血管内皮细胞（Decidual vascular endothelial cells,DVECs）,CCK-8法、划痕实验与血管形成实验检测抗aPL对血管内皮细胞增殖、迁移与血管形成的影响。4.RT-PCR与Western blot检测aPL对血管内皮细胞VEGF与MMP-2表达的影响。5.Western blot检测aPL通过ERK通路对血管内皮细胞VEGF与MMP-2表达的影响。6.采用Western blot、划痕实验与血管形成实验aPL通过ERK通路对血管内皮细胞迁移和血管形成的影响。7.CCK-8法检测HCQ对血管内皮细胞活力的影响;划痕实验与血管形成实验检测HCQ对aPL抑制血管内皮细胞迁移与血管形成能力的影响。8.RT-PCR与Western blot实验检测HCQ对aPL抑制血管内皮细胞ERK磷酸化、VEGF与MMP-2表达的影响。实验结果:1.HCQ治疗难治性OAPS患者并发RSA的临床疗效与药物安全性结果显示:与抗凝治疗比较,HCQ联合抗凝剂能有效降低难治性OAPS患者的流产发生率;能显著降低患者血清中aCL与LAC 阳性率;能显著降低患者血清中aCL与aβ2GPI平均滴度水平;能显著减少中高滴度水平aβ2GPI、aCL、LAC阳性率与aPL三阳性比率;单因素分析发现中高滴度aβ2GPI、中高滴度aCL、LAC阳性率与aPL三阳性是aPL引起RSA的相关因素;抗凝联合HCQ并不增加OAPS患者发生不良反应的机率。2.aPL抑制血管内皮细胞的增殖能力CCK-8实验结果显示aPL对HUVEC与DVEC细胞增殖能力的抑制作用具有时间和浓度依赖性。3.aPL抑制血管内皮细胞的迁移与成管能力细胞划痕实验与成管实验结果显示:aPL处理HUVEC与DVEC细胞后,细胞的迁移面积显著减少,细胞形成小管数目也均显著减少,表明aPL能显著抑制HUVEC与DVEC细胞的迁移与成管能力。4.aPL抑制血管内皮细胞内VEGF和MMP-2的表达水平RT-PCR与Western blot实验结果显示:HUVEC与DVEC细胞内VEGF和MMP-2的表达水平被aPL显著抑制。5.aPL可能通过抑制ERK通路减少血管内皮细胞内VEGF与MMP-2的表达,抑制血管内皮细胞迁移和血管形成实验结果显示:aPL下调HUVEC与DVEC细胞内ERK磷酸化时,VEGF与MMP-2表达水平也是减少的,HUVEC与DVEC细胞迁移面积与小管形成数量也显著减少;ERK激活剂上调被aPL抑制的ERK磷酸化水平时,VEGF与MMP-2表达水平随之升高,HUVEC与DVEC细胞迁移面积与小管形成数量也显著增多。表明aPL可能通过抑制ERK通路减少HUVEC与DVEC细胞内VEGF与MMP-2的表达,抑制细胞迁移和血管形成能力。6.HCQ对血管内皮细胞活力的影响CCK-8实验显示:HCQ在浓度为0～10 μg/ml时,对HUVEC与DVEC细胞活力无显著性影响,当HCQ浓度为100 μg/ml时,HUVEC与DVEC细胞活力均显著被抑制。表明HCQ作用血管内皮细胞是有一定浓度范围的,浓度过高会引起细胞活力下降。在本实验中选择1 μg/ml作为HCQ在后续实验中的作用浓度,这与已有研究中应用的浓度一致。7.HCQ改善aPL对血管内皮细胞迁移与血管形成的抑制作用成管实验与划痕实验显示:aPL减少HUVEC与DVEC细胞迁移面积、小管的数目,在加入HCQ后,细胞迁移面积、小管的数目显著改善。表明HCQ能显著改善aPL对HUVEC与DVEC细胞迁移与血管形成的抑制作用。8.HCQ改善aPL对血管内皮细胞中ERK磷酸化、VEGF与MMP2表达水平的抑制作用RT-PCR实验与Western blot实验显示:HCQ能恢复aPL对HUVEC与DVEC细胞ERK磷酸化、VEGF与MMP-2表达水平的抑制,这种恢复作用与NC组无显著性差异;aPL不存在时,HCQ未影响HUVEC与DVEC细胞ERK磷酸化、VEGF与MMP-2表达。结论:1.HCQ能显著降低难治性OAPS患者流产发生率与aPL滴度水平,中高滴度aβ2GPI、中高滴度aCL、LAC与aPL三阳性是aPL引起RSA的相关因素,HCQ未增加患者药物不良反应风险,在妊娠期应用具有一定的临床疗效,有望成为治疗难治性OAPS的基础药物。2.aPL可能通过调控ERK通路来抑制HUVEC与DVEC细胞中VEGF与MMP-2的表达,进而抑制子宫蜕膜组织中血管内皮细胞的增殖、迁移与血管形成能力。3.HCQ可能通过改善aPL对HUVEC与DVEC细胞ERK磷酸化、VEGF和MMP-2表达的抑制作用,发挥对子宫蜕膜组织血管内皮细胞迁移与血管形成能力的保护作用。