MAPK信号通路在氯化镉诱导星形胶质细胞凋亡中作用的初步研究

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目的:①体外分离、培养及鉴定星形胶质细胞;②研究氯化镉对体外培养的星形胶质细胞凋亡发生的影响;③探讨 MAPK信号通路是否参与了镉诱导星形胶质细胞的凋亡过程。  方法:①取新生24h内SD大鼠大脑皮质组织,采用恒温摇床的方法纯化星形胶质细胞,体外培养传至第三代,采用GFAP免疫细胞化学法鉴定星形胶质细胞;②以0、2.5、5、10、20、40μmol/L染毒12h、24h,MTT法测定氯化镉对星形胶质细胞的毒性作用;③以0、2.5、5、10、20、40μmol/L氯化镉染毒12h,倒置相差显微镜下观察细胞形态变化;④以20μmol/L氯化镉染毒12h(对照组为0μmol/L氯化镉的无血清DMEM作用12h),透射电镜观察星形胶质细胞超微结构变化;⑤以0、2.5、5、10、20μmol/L氯化镉染毒12h,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率;⑥以0、2.5、5、10、20μmol/L氯化镉染毒12h,Western blot方法检测ERK磷酸化水平和ERK水平。  结果:①纯化后的星形胶质细胞,胞体大而扁,胞突丰富,初级胞突较多且长.细胞传两代后,经GFAP免疫细胞化学染色,阳性细胞胞浆和突起呈棕黄色,星形胶质细胞纯度达95%,可用于后续实验。②MTT法检测结果显示氯化镉对星形胶质细胞有一定的细胞毒性,镉浓度为2.5μmol/L时在各时间点(12h、24h)均未引起细胞存活率下降;细胞存活率在12h、24h时间点随着染毒剂量(5~40μmol/L)的逐渐增加而下降,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。③倒置相差显微镜观察细胞形态变化:镉浓度为(0~5μmol/L)时,星形胶质细胞形态并未见到明显改变;10μmol/L时细胞突起变细变短,细胞间隙增大,细胞无脱落现象;20μmol/L时,胞体收缩,突起消失或成毛刺状,细胞稀疏,部分细胞收缩成球形,贴壁能力下降;40μmol/L时,细胞收缩成球形,大部分细胞脱壁,漂浮于细胞培养液中;④透射电镜观察结果:对照组:胞核形态规则,各细胞器形态正常;20μmol/L染毒12h:胞核形态不规则,核膜内陷,线粒体呈现空泡样变。⑤Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率结果:0、2.5、5、10、20μmol/L氯化镉作用12h,细胞凋亡率分别为2.47%,2.71%,4.74%,17.78%,30.51%,(5~20μmol/L)镉浓度时细胞凋亡率随着染毒剂量的增加而增加,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。⑥Western blot检测结果:(10、20μmol/L)氯化镉处理12h,ERK1/2磷酸化水平增加,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01);而总ERK1/2无变化。  结论:①氯化镉对星形胶质细胞具有明显的毒性作用;②氯化镉可诱导星形胶质细胞凋亡;③MAPK通路参与了镉诱导星形胶质细胞凋亡过程。
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