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猪瘟病毒(CSFV)E2基因是目前研制猪瘟基因工程疫苗的首选基因,其所编码的gp55蛋白是CSFV的主要保护性抗原。采用猪睾丸细胞(ST)做为受体细胞,结合使用哺乳动物细胞表达载体来表达E2基因,首先可充分利用受体细胞遗传密码子的嗜好性提高重组蛋白的表达量,另外因ST来源于猪,其后加工与其他表达宿主相比具有优越性,其疫苗的免疫保护力和免疫原性有望得到进一步提高,为CSFV基因工程苗推广应用奠定基础。本研究包括三个试验内容,首先对CSFV福建地方流行株FJ1和FJ2株的E2基因进行了克隆与测序,分析与猪瘟(CSF)疫苗C株的同源性,初步了解福建地方分离株的变异情况。其次利用反转录PCR(RT-PCR)和套式PCR(nPCR)方法,对多次ST传代的和多次动物传代的CSF石门强毒株(Shimen株)E2基因的序列分别进行了测定,并与标准Shimen株E2基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性进行比较,旨在探讨CSFV在ST中多次传代后的遗传稳定性。最后利用ST作为受体细胞来表达CSFV的E2基因,为建立用重组蛋白作为抗原的CSFV检测方法和CSF基因工程疫苗的应用奠定基础。本研究试验与结果如下:1.使用PCR技术分别扩增2株CSF福建地方流行毒株的E2基因,并克隆于pMD-18T载体进行核苷酸测序,根据CSFV的Alfort株、Brescia株及C-株(疫苗毒)确定起始氨基酸三联体位置后进行氨基酸序列推导,同时进行同源性比较和E2蛋白结构分析。结果显示,FJ1和FJ2株的E2基因的长度均为1170 bp,编码的氨基酸序列长度均为384个氨基酸,包括完整的信号肽和部分跨膜序列。2毒株的E2基因核苷酸序列同源性为90.79%,氨基酸序列同源性为89.84%,其与C-株E2基因的核苷酸序列同源性为82.87%-82.96%,氨基酸序列同源性为87.76%-90.10%,结果表明,2008年福建部分地区CSF流行毒与C-株的E2蛋白之间存有一定差异,这为当前CSF防控奠定一定理论与物质基础。2.CSFV Shimen株经猪体多次传代和ST多次传代后,得到传代病毒P-Shimen和ST-Shimen。利用PCR技术分别扩增P-Shimen和ST-Shimen株E2基因,并进行核苷酸序列测定,比较分析P-Shimen株、ST-Shimen株及Shimen标准株的E2基因核苷酸和氨基酸序列同源性。结果发现,P-Shimen株和Shimen标准株核苷酸序列同源性为99.4%,氨基酸序列同源性为99.0%,ST-Shimen株和Shimen标准株的核苷酸序列同源性为98.3%,氨基酸同源性为96.7%,结果显示,ST-Shimen株E2基因较P-Shimen株的变异差异不明显,并与Shimen标准株保持较高的同源性,结果表明了CSFV在ST中能保持其遗传的相对稳定性,为ST作为CSF疫苗制备的工具细胞提供可能。3.克隆CSFV的E2基因至pEGFP-C1真核表达载体上,使用脂质体法将重组质粒转染入ST中,通过荧光观察和G418筛选出阳性细胞克隆。荧光观察和PCR检测表明E2基因已导入阳性细胞克隆;使用免疫组化试验表明表达的蛋白为CSFV的E2蛋白,这为以重组蛋白为抗原的CSFV检测方法的建立和CSF基因工程疫苗的应用奠定基础。