背景:复发性流产（recurrent spontaneous abortion,RSA）可造成反复妊娠丢失,其发生机制目前尚未完全明确。机体微炎症状态的存在可致使胎盘血管生成受阻,从而使得胚胎缺血缺氧,引发流产;同时炎症介质释放时,中性粒细胞被激活,产生大量氧自由基,氧自由基可引发氧化应激反应,从而进一步强化氧化和炎症之间的连锁反应,导致流产的发生。铁死亡是一种非凋亡可调控的细胞死亡方式,依赖于铁累积和脂质过氧化的驱动,可导致氧化和抗氧化系统失衡、炎症因子大量释放和免疫系统异常。目前对于复发性流产与铁死亡相关机制的研究较少。本文首先通过临床回顾性研究分析RSA患者炎症、血脂、氧化应激相关的血清学指标,其次通过生物信息学方法初步研究铁死亡与RSA的相关性,构建诊断模型并分析免疫特征,为RSA的机制探究提供理论依据,为RSA在临床中的诊断、治疗提供新思路。第一章:通过回顾性研究对比RSA和对照组患者炎症指标、血脂和尿酸水平目的:对比RSA与对照组患者的炎症指标、血脂和尿酸水平是否存在差异,判断炎症、血脂和氧化应激与患RSA风险是否相关。方法:查阅2019年1月至2021年12月在我院行体外受精（in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection,IVF/ICSI）助孕的458例患者的临床病历资料并收集,其中RSA患者214例,因男方因素或女方输卵管因素助孕的对照组患者244例,对两组患者临床病例资料进行回顾性分析。首先分别对比两组患者的一般资料、炎症指标、血脂和尿酸水平;其次,将两组患者按年龄大小分成年龄≤35岁和年龄＞35岁两个年龄段,将两组患者按体重指数（Body Mass Index,BMI）分成偏瘦（BMI＜18.5 kg/m~2）、正常（18.5≤BMI＜24.0 kg/m~2）、超重（24.0≤BMI＜27.9 kg/m~2）和肥胖（BMI≥28.0 kg/m~2）四个组,然后,通过相关性分析及不同年龄、不同BMI分层进一步比较炎症指标、血脂水平,利用二元logistic回归判断炎症指标、血脂和尿酸与患RSA风险是否相关,利用ROC曲线判断炎症、血脂和尿酸是否成为预测RSA发生的指标;最后,按尿酸水平使用四分位法将患者分为4组,分别为第1四分位数（～P25,UA≤230umol/L）记为U1组,第2四分位数（P25-P50,230＜UA≤260umol/L）记为U2组,第3四分位数（P50-75,260＜UA≤300umol/L）记为U3组,第4四分位数（P75～,UA＞300umol/L）记为U4组,尿酸分层联合BMI将两组患者分为B1-B8共8个组,非肥胖及尿酸水平分别在U1、U2、U3、U4范围的患者被分别纳入B1、B2、B3、B4组,肥胖及尿酸水平分别在U1、U2、U3、U4范围的患者被分别纳入B5、B6、B7、B8组,利用二元logistic回归分析探究血清尿酸水平联合BMI与患RSA的风险之间的关系,并使用限制性立方样条图进一步分析。结果:1.与对照组患者相比,RSA患者的白细胞（WBC）、中性粒细胞绝对值（NEUT#）、NLR、SII显著升高（P＜0.05）。RSA患病与白细胞、中性粒细胞、NLR、SII水平均呈正相关（P＜0.05）;RSA患者NLR与年龄存在正相关（P＜0.05）;对照组患者白细胞、中性粒细胞绝对值与年龄存在负相关（P＜0.05）;未发现上述炎症指标和BMI有显著关联关系。分别以年龄两个分组、NLR、SII为自变量,RSA患病与否为因变量,采用二元logistic回归分析显示:在年龄≤35岁的女性中SII显著增加RSA的患病风险[OR=1.002,95%CI（1.001～1.003）],在年龄＞35岁的女性中NLR显著增加RSA的患病风险[OR=2.686,95%CI（1.062～6.795）];SII、NLR与年龄联合预测的价值高于SII和NLR单独的预测价值,联合预测AUC=73.44%。2.RSA患者的TC、TG和LDL与对照组患者之间存在显著差异（P＜0.05）,HDL在两组间无统计学差异（P＞0.05）,患RSA的风险与TC、TG和LDL升高具有显著相关性;RSA患者TC、TG与年龄具有显著正相关关系,TG与BMI具有显著正相关关系;对照组患者TC、LDL与年龄具有显著正相关关系,TG、LDL与BMI具有显著正相关关系;与同年龄段的对照组患者相比,年龄≤35岁的RSA患者LDL明显升高,差异具有统计学意义（P＜0.01）;同年龄段的对照组患者相比,年龄≤35岁的RSA患者的TC、TG较高,HDL-C略偏高,年龄＞35岁的RSA患者的TG、HDL较高,TC、LDL较低,差异无统计学意义（P＞0.05）;与同一分层的BMI对照组患者相比,偏瘦组和正常组的RSA患者LDL显著升高,超重组的RSA患者TC、LDL较低,TG、HDL较高,肥胖组的RSA患者TC、TG、HDL、LDL较低,差异无统计学意义（P＞0.05）。分别以年龄两水平、BMI、TC、TG、LDL为自变量,RSA患病与否为因变量,采用二元logistic回归分析显示:LDL使RSA的患病风险显著增加[OR=2.206,95%CI（1.208～4.027）];LDL与BMI和年龄联合预测价值高于LDL单独的预测价值,联合预测AUC达73.92%。3.与对照组患者相比,RSA患者尿酸显著升高（P＜0.05）,两组患者尿酸的分布大致相似（四分位数比较接近）,但在RSA患者中有更多的离群值。RSA患病与尿酸存在正相关（P＜0.05）;尿酸四个水平在RSA中的构成比分别为27.1%、21.4%、21.4%、30%,高水平尿酸组RSA的构成比大于低水平尿酸组,卡方检验提示组间均有显著差异。采用二元Logistic回归分析显示,在非肥胖患者中,与B4组相比,低水平尿酸组患RSA的几率更小,尿酸在260-300umol/L之间患RSA的风险最低。尿酸与BMI联合预测AUC=60.02%。限制性立方图显示尿酸在260-290umol/L不会增加RSA患病的风险。结论:1.RSA患者的NEUT#、NLR和SII与对照组患者之间存在显著差异,患RSA的人群中NEUT#、NLR和SII显著升高,SII和NLR可预测RSA的患病风险,与年龄联合预测价值更高;2.RSA患者的TC、TG和LDL与对照组患者之间存在显著差异,患RSA的人群中血清LDL显著升高,在年龄≤35岁以及体重正常和偏瘦的患者中更加显著,血清LDL对于患RSA的风险具有较好的预测价值,与年龄和BMI共同预测价值更大;3.RSA患者的尿酸与对照组患者之间存在显著差异,尿酸在260-290umol/L不会增加RSA患病的风险。第二章:基于生物信息学方法初步研究复发性流产与铁死亡的相关性目的:本研究主要有以下四个研究目的:1.筛选出RSA中与铁死亡相关的潜在的诊断和治疗靶点基因,分析其可能参与的通路;2.筛选出RSA中与铁死亡相关的关键基因,分析关键基因涉及的通路,使用关键基因构建诊断模型并验证其稳定性;3.分析RSA患者免疫浸润的情况及免疫细胞含量与关键基因之间的关系;4.构建miRNA-mRNA网络。方法:1.本研究从NCBI GEO公共数据库下载GSE76862的Series Matrix File数据文件,使用limma包进行差异基因分析,差异基因筛选条件为P＜0.05＆|Log2FC|＞0.585;铁死亡相关基因提取自Gene Cards数据库（https://www.genecards.org/）,差异基因与铁死亡相关基因取交集,得到RSA中铁死亡相关基因,使用Metascape数据库（www.metascape.org）对RSA中铁死亡相关基因进行功能富集分析得到其可能参与的通路;2.RSA中铁死亡相关基因通过Lasso回归进行特征筛选,识别出的关键基因作为特征基因构建预测模型,并采用ROC曲线和数据集GSE22490数据通过内部和外部数据验证诊断模型的准确性;使用GSEA分析关键基因高表达组以及低表达组参与的信号通路,找到可能参与RSA的通路;3.使用CIBERSORT算法对数据集中正常组和RSA组患者数据进行分析推断22种免疫细胞的相对比例,采用“vioplot”包绘制免疫细胞的相对含量高低,评价基因对免疫浸润的影响,并对基因表达量和免疫细胞相对含量进行相关性分析;4.联合mircode网站（http://mircode.org）反向预测mRNA与miRNA的相互作用,建立miRNA-mRNA网络,使用cytoscape进行可视化。结果:1.GSE76862数据集中,在正常组和RSA组间我们共筛选出1102个差异基因,表达上调的基因有444个,表达下调的基因有658个;我们从Gene Cards数据库中提取铁死亡相关基因260个,对筛选的差异基因与提取的铁死亡相关基因取交集,共得到RSA中铁死亡相关基因22个,通过GO分析和KEGG分析结果显示这22个基因主要集中在泛素蛋白连接酶结合、铁死亡、ATP依赖行为、TGFβR信号通路、氧化应激反应、mRNA合成和剪切的调控、核分裂和细胞器组织的正向调节等通路及生物过程中;2.我们筛选得到了三个关键基因:NCOA4、PRDX2、MAP1LC3B,与对照组相比,MAP1LC3B在RSA患者中高表达,NCOA4和PRDX2在RSA患者中低表达,进一步使用三个关键基因构建的预测模型公式为:score=NCOA4×（-0.185）+PRDX2×（-0.145）+MAP1LC3B×0.0167,使用内部数据进行ROC验证显示3个基因构建的预测模型具有较好的诊断效能,以数据集GSE22490作为验证集,进一步验证诊断模型,AUC为70.83%,模型具有较强的稳定性;我们通过GSEA分析结果显示高表达MAP1LC3B基因主要参与m TOR信号通路、白细胞跨内皮迁移、P53信号通路、自噬调节、甘油酯代谢、嘌呤代谢等相关通路,低表达的NCOX4参与花生四烯酸代谢、Hh信号通路、TGFβ信号通路、TOLL样信号通路等相关通路,低表达的PRDX2参与亚油酸代谢、脂肪酸代谢、NOD样受体信号通路、B细胞受体信号通路、白细胞经内皮迁移等相关通路,提示以上关键基因可能通过脂类代谢、氧化应激、炎症、自噬、免疫等方面影响RSA进展;3.我们通过分析免疫细胞的相对含量发现,与正常组患者相比,RSA患者静息树突状细胞显著升高,差异有统计学意义,静息的记忆性CD4+T细胞、活化的记忆性CD4+T细胞、滤泡辅助性T细胞及γδT细胞只在RSA患者中表达,正常组中均没有表达,其他相关免疫细胞之间有差异,但没有统计学意义,进一步分析3个关键基因NCOA4、PRDX2、MAP1LC3B与免疫细胞含量均有较强的相关性;4.3个关键基因进行反向预测相关miRNA,共预测出154个miRNA及241对mRNA-miRNA关系对,我们通过预测结果构建了关键基因相关的miRNA网络;结论:1.本研究通过生物信息学方法筛选出22个RSA中铁死亡相关潜在靶点基因及3个关键基因,可能成为RSA机制探究及治疗和诊断靶点;2.基于3个关键基因（NCOA4、PRDX2、MAP1LC3B）构建的诊断模型经内部和外部数据验证具有较强的稳定性;3.RSA患者中静息树突细胞较正常组显著升高,其异常可能对RSA的发生发挥重要作用;4.关键基因可能通过脂类代谢、氧化应激、炎症、自噬、免疫等相关通路影响RSA发生。