高温应激对鱼类生长性能方面的不利影响已被大家所公认,但高温应激与能量代谢尤其是脂质代谢关系的研究报道却很少。脂质代谢是机体非常重要但错综复杂的生化反应,作为最重要的三大代谢之一,能够保障机体正常的生理机能的运作,对于生命活动具有非常重要意义。脂质分子是机体储存能量和供给能量的重要物质,也是生物膜的重要结构成分。脂质代谢失衡紊乱通常会导致各种疾病的发生。本论文以大菱鲆为研究对象,首次通过多组学分析方法挖掘高温应激下脂代谢关键基因和关键代谢物,然后运用分子生物学、细胞生物学等手段对脂代谢调控中的关键代谢通路进行深入研究,以解析高温胁迫下大菱鲆脂代谢调控机制。研究结果将有助于理解大菱鲆环境适应机理,促进耐温新品种的选育,对水产养殖业的发展具有积极的意义,为鱼类耐温过程中能量代谢尤其是脂质代谢的调节机制开辟一个新的研究视野。主要的研究内容和研究结果如下:1.整合代谢组和转录组分析揭示热应激影响大菱鲆幼鱼的脂代谢本实验以大菱鲆为养殖对象,设置不同高温（20℃、25℃和28℃）刺激大菱鲆后取肾脏组织分别进行转录组测序和代谢组测序,以转录组数据和代谢组数据为基础鉴定差异表达的基因和代谢产物。结果说明:根据KEGG通路分析发现显著差异基因和显著差异代谢物共富集在七条与脂质代谢相关的通路中,分别是类固醇激素生物合成、初级胆汁酸生物合成、甘油磷脂代谢、亚油酸代谢、鞘脂代谢、,甘油脂代谢和不饱和脂肪酸的生物合成。对通路上的差异表达基因和差异代谢物进行相关性分析后,根据相关性系数大小筛选到最具代表性的六个显著差异基因（lpcat2、Etnk1、TAZ、SCP2、ch25hl和gpd1l）和五个显著差异代谢物（胞磷胆碱、UPD-6-磺基喹啉、二羟基丙酮、牛磺酸和邻磷胆碱）。通过对筛选到的基因和代谢物在不同温度下的表达模式分析发现它们分别在热应激下通过不同程度的上调或下调调节脂质沉积和维持脂质稳态,从而缓解热应激引起的脂质代谢紊乱。2.利用转录组分析技术揭示高温改变大菱鲆幼鱼肝脏的脂代谢调控模式本团队前期在分析大菱鲆各组织对高温应激的响应时,发现除了肾脏,肝脏也是一个重要的高温应激响应组织,同时肝脏还是机体代谢过程中不可或缺的器官之一。因此,本实验模拟了大菱鲆养殖过程中可能出现的高温环境（20℃、24℃和28℃）。采用高通量测序技术研究高温胁迫下大菱鲆幼鱼肝脏脂质代谢的响应规律。结果显示:通过对转录组数据进行组装、注释后,共鉴定出2067个响应高温的显著差异表达基因（DEGs）。对DEGs进行GO分析、KEGG分析以及趋势分析后共发现49个参与脂质代谢途径DEGs,它们主要集中在甘油磷脂代谢、类固醇生物合成、甘油脂代谢、脂肪酸代谢途径、以及过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号通路上。为了进一步探究筛选出的脂质代谢显著差异基因可能的转录调控,我们构建了一个调控网络。我们推测高温通过与脂肪酸等配体的相互作用激活PPAR信号通路。一方面,该通路中的HMGCS1基因通过下调类固醇生物合成途径关键基因（SQLE、EBP和DHCR24）的表达来抑制固醇合成。另一方面,该通路中ACSL1的表达在高温条件下显著增加,这可能在调节脂肪酸代谢中发挥重要作用。此外,我们采集血液,检测血清参数的变化,发现甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）低密度脂蛋白（LDL）含量均呈现先升高后逐渐降低的趋势。这些结果表明,在高温条件下,肝脏脂质代谢在大菱鲆的高温应激过程中也具有重要的调节作用,并且PPAR信号通路在响应高温胁迫时对脂代谢的调控作用得以突显。3.大菱鲆PPARs基因的克隆结构表征及高温胁迫下调控脂代谢的功能研究PPAR信号通路以PPARs家族基因为核心,PPARs家族基因在哺乳动物中调控脂质代谢的重要作用已得到广泛研究,但在海水鱼中却涉及较少。本实验对PPARs家族基因进行克隆,确定大菱鲆PPARs家族基因存在的亚型;对基因进行生物信息学分析,了解基因结构和预测基因可能发挥的作用;通过抑制剂和RNA干扰实验抑制PPARs家族基因的表达,检测PPARs下游脂代谢基因的表达水平以阐明热应激过程中大菱鲆PPARs调控脂代谢的作用机制。结果显示:大菱鲆PPARs家族基因存在三个亚型,分别是α、β和γ。PPARα的编码区（CDS）序列长1410bp,编码469个氨基酸。PPARβ的CDS序列长1533 bp,编码510个氨基酸。PPARγ基因的CDS长度为1659 bp,编码552个氨基酸。结构分析表明三亚型均具有一个C4型锌指结构域（ZNF-C4）和一个HOLI结构域。系统发育分析表明三亚型在进化过程中高度保守。高温胁迫下PPARαm RNA水平显著升高,脂质合成基因FASN和SCD表达显著下调。PPARα的体内干扰和细胞抑制结果显示,FASN和SCD的表达水平显著升高。q PCR结果显示,高温激活了PPARβ的转录活性,提高了ACOX和CPT-1基因的活性。在高温环境中通过RNAi技术和抑制剂处理下调PPARβ时,可显著抑制ACOX和CPT-1的表达,提示PPARβ在高温中正向调控ACOX和CPT-1的表达,从而调节脂质分解代谢活性。高温实验显示PPARγ表达水平在高温应激下表达量显著升高,脂肪酸转运蛋白FATP和CD36的表达在高温下也显著增加。通过RNAi体内干扰PPARγ活性和细胞中抑制PPARγ活性,可显著降低脂质转运蛋白FATP和CD36的表达。综上,PPARs三个亚型均被高温激活,激活后三亚型分别通过抑制脂质合成、促进脂质分解代谢和调节脂质转运发挥不同的调节作用以减少脂质沉积,从而维持大菱鲆脂质代谢稳态。4.探究高温胁迫下饲料添加牛磺酸对大菱鲆生长性能和脂代谢的影响第一部分实验已经证明,牛磺酸在大菱鲆响应高温时发挥重要作用。牛磺酸是重要的营养物质,饲料中补充牛磺酸可促进机体生长并有效缓解各种应激反应。但牛磺酸摄入后如何影响大菱鲆脂质谱尚不清楚。本实验首先设置了常温（15℃）和高温（24℃）两个温度点,每个温度点下制备4个牛磺酸水平（0%、0.4%、1.2%和2%）的饲料投喂大菱鲆以研究不同温度下牛磺酸水平对大菱鲆生长性能的影响,接着运用分子生物学、病理学和脂质组学结合探究了大菱鲆高温胁迫以及牛磺酸添加后脂质代谢的变化。结果表明:在15℃时,0.4%～2%的牛磺酸添加量均可促进大菱鲆生长,而在24℃高温时,仅有2%的牛磺酸添加对大菱鲆的生长存活是有积极影响的。组织病理学发现15℃未添加组的肾脏单位形态正常,未见明显变化。24℃未添加组肾小球及肾间质毛细血管管腔扩张、充血严重,肾小管数量减少,部分肾小管上皮细胞肿胀,管腔狭窄。而添加2%牛磺酸后肾小球肿胀和间质充血得到明显缓解。脂质组学结合血脂指标分析发现甘油磷脂类包括磷脂酸PA、磷脂酰乙醇胺PE、磷脂酰胆碱PC和鞘脂类包括葡萄糖基神经酰胺Hex1Cer、因鞘磷脂SM的含量在响应高温胁迫时显著降低,添加牛磺酸后显著升高。而甘油三酯TG、甘油二酯DG等甘油脂类含量在高温胁迫时显著升高,但在牛磺酸饲粮干预后并未显著降低,仍保持较高水平。综上表明,高温胁迫可能通过降低大菱鲆肾脏磷脂分子的含量来影响生物膜的稳定性、通透性和流动性,从而对组织造成损伤,而添加2%的牛磺酸后通过提高磷脂分子的含量能够缓解组织损伤。同时高温胁迫会导致大菱鲆肾脏组织内脂质积累,并诱导体内的血脂异常,但添加牛磺酸并不能改善脂质积累。