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猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp)是引起猪支原体肺炎(Mycoplasma pneumoniae of Swine, MPS)的主要病原,该病是一种高传染率低死亡率的猪慢性呼吸道疾病。目前虽已发现了一些与Mhp毒力相关的蛋白,但对Mhp强弱毒株中差异蛋白的研究报道甚少。本试验提取来源于同一母本株的猪肺炎支原体168强弱毒株的全菌蛋白,采用双向电泳技术(Two-dimensional Electrophoresis,2-DE)对全菌蛋白进行分离,在强毒株的凝胶上共检出207+6个蛋白点,在弱毒株的凝胶上共检出153+4个蛋白点。对强弱毒株的蛋白点进行比对和表达量分析,发现差异点共62个,其中52个仅出现在Mhp168强毒株的图谱上,3个仅出现在Mhp168弱毒株的图谱上；7个蛋白点为强弱毒株图谱所共有,其中3个蛋白点强毒株内表达量较高,4个蛋白点在弱毒株内表达量较高。在对24个蛋白点进行质谱分析中,成功鉴定了19个蛋白点,其中4个是血清蛋白,4个为酶类,1个是蛋白前体,1个是假想蛋白,1个是未知蛋白产物(未收录于蛋白数据库中)。经Western-blot验证,发现其中的P36蛋白具有较好的免疫原性。然后根据GenBank公布的Mhp P36的全基因序列,设计合成1对引物,通过PCR扩增目的基因,将扩增的目的基因插入表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a(+) P36.将重组质粒pET-28a(+) P36导入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,经1%IPTG诱导表达5h后,蛋白的表达量达最高。采用Protino Ni-TED2000Packed Columns进行亲和纯化,获得纯度较高的目的蛋白,进一步Western-blot分析表明表达蛋白具有良好的反应原性,可作为抗原应用于Mhp的ELISA诊断。利用2-DE和Western-blot对同一来源的猪肺炎支原体168强弱毒株的差异蛋白进行分析及免疫相关的研究,为该病原致病机理和防制的进一步研究奠定了基础。