目的糖尿病是一种多病因的代谢性疾病,随着20世纪社会的进步和生活方式的改变,糖尿病已日益成为威胁人类健康的卫生保健问题。胰岛素抵抗(IR)及胰岛β细胞功能受损是2型糖尿病发病的两大病理生理基础。2型糖尿病与肥胖紧密相关已经成为一种共识。肥胖者由于体内脂肪组织的过度积聚,导致释放过多的游离脂肪酸(Free Fatty Acid,FFA),进而引发一系列病理生理反应,称为“脂毒性”,该学说包括了FFA引起的IR以及β细胞结构和功能的改变,这与FFA直接作用于酶类,离子通道,信号分子/转录因子有关,亦与FFA诱导活性氧簇(ROS)有关。IR与胰岛素信号转导的各个环节、调控糖脂代谢的多种基因的表达和多态性相关。胰岛素受体信号转导通路异常包括受体前通路异常;受体水平的异常;受体后异常(包括IRS-1基因突变,GluT4异常等)。目前对胰岛素受体后途经研究较多,在外周靶组织,胰岛素与其受体结合后,激活β亚单位上的酪氨酸,使其磷酸化,导致胞质内酪氨酸激酶活性升高,胰岛素受体底物(IRS-1)的酪氨酸磷酸化,SH2的特定氨基酸的序列与IRS-1上磷酸化酪氨酸结合,磷脂酰激醇3激酶(PI-3K)被激活,使GLUT4向细胞膜转位,细胞摄取葡萄糖,出现胰岛素效应称为胰岛素信号转导的PI-3K途径。PKC是细胞内信号传导通路上的一个重要成员,催化胰岛素受体(IR)和胰岛素受体底物-1(IRS-1)蛋白的丝氨酸/苏氨酸的磷酸化反应,使磷酸肌醇-3激酶(PI-3K)的活性降低,减弱细胞内信号传导。同时,PKC是氧化应激的介导物,能活化细胞NAD(P)H氧化酶,诱导ROS的合成以及随后的脂质过氧化,同时使还原型谷胱甘肽酶(GSH)转化为氧化型谷胱甘肽酶(GSSG),多种抗氧化酶活性降低:ROS又作为类似于第二信使的信号分子,激活许多氧化还原敏感性信号通路,这些通路包括核因子κB(NFκB)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、JNK、己糖胺等。这些通路激活后,使氧化还原敏感性丝氨酸/苏氨酸激酶信号级联活化,抑制了胰岛素刺激的酪氨酸磷酸化。结果,胰岛素信号传导通路下游信号分子如PI-3K、AKt等的相关性和(或)活性降低,GluT4的表达和转运下降,减少了胰岛素的生物效应,此为FFA通过PKC间接诱导氧化应激导致的胰岛素抵抗。另外,FFA水平的升高可直接使ROS增多,通过氧化应激降低β细胞中特异表达的转录因子—胰腺和十二指肠的同源形基因因子-1(PDX-1)的表达,从而抑制胰岛β细胞胰岛素的基因转录。虽然许多资料发现输注脂肪乳后的3～4小时,行正血糖高胰岛素钳夹试验证实肝糖生成增加,但目前FFA升高,尤其是FFA慢性升高引起IR的机制尚未完全阐明。我们给Wistar大鼠延长静脉输注脂肪乳至48小时,模拟糖尿病患者脂代谢紊乱内环境,观察慢性FFA升高造成的脂毒性对胰岛素抵抗的影响,探明PKC-δ在其中的作用,以及其对胰岛素信号通路上的GluT-4和胰岛β细胞合成胰岛素的影响。实验方法一、动物模型的制备1、正常雄性Wistar大鼠重250～300克,给予常规饲料喂养并自由饮水,日夜周期为12小时,经过3～5天的环境适应。2、大鼠颈部动、静脉置管术:术前禁食12小时,10%水合氯醛(0.35ml/kg)腹腔麻醉后,进行颈部动静脉插管:导管分别插入右侧颈静脉以输注液体,左侧颈动脉以抽取动脉血留取样本。静脉导管置于右心房水平,动脉导管置于主动脉水平。两侧的导管均经皮下延续至背部外置,导管内充以60%PVP和肝素(1000~U/ml)的混合液保持导管通畅,防止血液返流,末端用金属钉封闭。所有大鼠术后均恢复3天,每天观察大鼠状况及测体重。二、实验分组:各亚组8只Wistar鼠(一)、盐水组(SAL)1、盐水基础亚组:静脉输注生理盐水0.3ml/h48小时。2、盐水钳夹亚组:静脉输注生理盐水0.3 ml/h48小时,输注的最后2小时行高胰岛素正血糖钳夹试验(胰岛素输注率为5 mU.kg-1.min-1)。(二)、脂肪乳组(IH)1、脂肪乳基础亚组:48小时静脉输注脂肪乳(20%脂肪乳+20 U/ml肝素),0.3 ml/h。2、脂肪乳钳夹亚组:48小时静脉输注脂肪乳,0.3 ml/h,最后2小时行高胰岛素正血糖钳夹试验,胰岛素输注率为5 mU.kg-1.min-1。每亚组实验结束,大鼠行腹腔麻醉,45秒内取肝脏,胰腺,骨骼肌,脂肪等组织,部分4%多聚甲醛固定、包埋,部分液氮冷冻后-70℃冰箱保存。三、检测指标及实验方法1、大鼠行48小时持续静脉输液(国内目前尚没有输液48小时的报道,最长7小时),钳夹亚组行高胰岛素-正血糖钳夹试验(评价胰岛素抵抗金标准)。2、葡萄糖氧化酶法检测血糖;放射免疫方法检测血浆胰岛素;比色法检测血浆游离脂肪酸水平。3、2,4-二硝基苯肼法检测肝脏羰基蛋白含量。4、Western Blot法检测肝脏PKC-δ以及GluT-4在细胞浆和细胞膜的蛋白表达。5、免疫组化方法比较两组胰腺组织胰岛素的含量,RT-PCR方法观察胰腺PDX-1mRNA表达的情况。四、统计分析应用SPSS10.0软件进行统计学分析。各组数据用(?)±s表示。两组数据间用t-检验,P＜0.05认为有统计学意义。实验结果1、48小时输注脂肪乳与盐水组比较FFA升高2.1倍,空腹血糖升高了1.26mmol/L,葡萄糖输注率降低了58.6%(P＜0.001)。2、脂肪乳组肝脏氧化损伤的指示物羰基蛋白水平较盐水组高3.2倍(P＜0.001)。3、盐水组,脂肪乳组肝脏细胞膜PKC-δ密度值分别为55.12±2.37,99.48±4.52;细胞浆PKC-δ密度值分别为49.37±1.96,21.64±0.83;盐水组与脂肪乳组肝脏胞膜PKC-δ/胞浆PKC-δ比值分别为1.12,4.60(P＜0.001)。4、盐水组、脂肪乳组肝脏细胞膜GluT-4密度值分别为37.69±1.20,16.28±0.55;细胞浆GluT-4密度值分别为20.34±1.03,41.92±1.74;盐水组与脂肪乳组肝脏胞膜GluT-4/胞浆GluT-4比值分别为1.85,0.39(P＜0.001)。脂肪乳组肝细胞膜GluT-4/肝细胞浆GluT-4的比值是对照组的21%(P＜0.001)。5、脂肪乳组胰腺组织中胰岛素的表达明显减少,为盐水组的55.60%;脂肪乳组、盐水组胰腺PDX-1mRNA的相对表达量分别为0.78±0.04,1.10±0.07,脂肪乳组为盐水组的71%(P＜0.05)。结论1、持续静脉48小时输注脂肪乳造成了空腹FFA及静脉血糖明显升高,高胰岛素正血糖钳夹实验后三十分钟两组平均血糖无统计学差异,但脂肪乳组葡萄糖输注率明显下降,证明高胰岛素正血糖钳夹试验成功;48小时输注脂肪乳造成了大鼠胰岛素抵抗。2、慢性脂毒性引起肝脏羰基蛋白含量升高,证实氧化应激在脂毒性造成的IR中起到了重要作用。3、脂肪乳组肝细胞膜PKC-δ的表达是盐水组的1.8倍,而肝脏细胞浆PKC-δ的表达为盐水组的24%,说明氧化应激可能通过诱导肝脏PKC-δ从细胞浆到细胞膜的转位引起IR,48小时输注脂肪乳引起的IR与PKC-δ的激活转位有关。4、脂肪乳组肝细胞膜GluT-4表达减少,因此减少了胰岛素的生物效应,导致葡萄糖利用下降。5、持续静脉48小时输注脂肪乳可以造成胰腺PDX-1mRNA及胰岛素表达下降,从而影响了胰岛β细胞胰岛素基因合成及表达。