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目的:研究中药香加皮提取物的体外抗肿瘤作用和免疫调节作用,分离纯化香加皮提取物的抗肿瘤活性成分,主要研究中药香加皮乙酸乙酯提取物(CPEAE)对人源性食管癌细胞株和小鼠脾细胞生长的作用,探讨其诱导细胞凋亡、细胞周期阻滞和提高免疫调节力的机制,为抗肿瘤新药的开发、研制提供科学依据。
方法:1.应用MTT法分析不同浓度的CPEAE对两种人源性食管癌细胞TE-13和Eca-109增殖的抑制作用;2.应用Gimsa染色法分析TE-13用药前后的细胞形态变化;3.应用流式细胞技术检测用药前后TE-13细胞周期分布和凋亡率的变化;4.应用琼脂糖凝胶电泳检测用药前后TE-13细胞DNA凋亡片段长度和数量的变化;5.应用Western blot方法检测TE-13细胞经药物处理前后细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4、CDK2蛋白表达水平的变化。6.采用MTT法检测CPEAE对小鼠脾细胞、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能、细胞因子分泌功能等的影响。
结果:1.CPEAE对TE-13和Eca-109两种细胞的增殖具有明显的抑制作用(P<0.01),CPEAE作用48h时,Eca-109细胞的半数抑制浓度(IC50)约为15μg/ml,TE-13细胞的半数抑制浓度(IC50)小于5μg/ml,并且呈时间和浓度依赖性,药物浓度越大,作用时间越长,对肿瘤细胞生长的抑制效应越强。
2.CPEAE作用于两种食管癌细胞后,可诱导较典型的细胞凋亡形态学变化,有的出现核固缩,核碎裂以及凋亡小体等。
3.经流式细胞学分析的DNA直方图上可见CPEAE作用后,TE-13细胞在G1峰前出现细胞凋亡峰亚G1期峰,且G0/G1期细胞增多(P<0.01),S期期细胞明显减少(P<0.01),G2/M期细胞没有明显变化(P>0.05)。25 μg/ml的CPEAE作用48h后,TE-13的细胞凋亡率高达49.2%,未处理组细胞凋亡率为4.18%;
4.琼脂糖凝胶电泳结果显示,经25 μg/ml和12.5 μg/ml的CPEAE处理48小时后,TE-13细胞DNA降解成寡聚核小体,出现明显的有规律的梯形条带。
5.Western blot结果显示CPEAE能降低TE-13细胞CDK4蛋白的表达(P<0.01),对CDK2蛋白的表达没有明显影响(P>0.05)。
6.CPEAE作用后,小鼠的脾的淋巴细胞的增殖有促进作用(P<0.01),巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用明显增强(P<0.01),同时,可提高巨噬细胞分泌TNF-α、IL-12等细胞因子的水平。
结论:1.CPEAE能显著抑制TE-13细胞的增殖,其作用机制可能与其诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡有关。
2.CPEAE还可通过机体的免疫调节机制发挥抗肿瘤作用。